甲基营养型芽孢杆菌ZH-9的筛选、鉴定及其对炭疽病的生物防治研究.pdf

摘要 摘要 黄瓜炭疽病是由半知菌葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichum orbiculare ）引起的真菌 性病害。该病害在我国发病比较广泛，危害严重，造成大规模减产。农民只好多量多 次喷施化学农药，不仅不利于病害可持续控制，而且会导致化学农药残留，也对绿色 环保的农业发展带来了负担。为了有效解决实际生产中存在的问题，且符合绿色生防 菌剂的研发趋势，本论文对秦岭太白山自然保护区森林土壤中的高效生防菌株进行了 开发及研究。旨在寻找出对黄瓜炭疽病有良好生防效果的微生物防治材料、为其生物 防治提供依据和基础。 从秦岭森林土壤中分离筛选到一株对黄瓜炭疽病有良好抑制活性的菌株ZH-9 。先 随机采样20 份，通过单孢分离纯化得到143 株细菌，然后用平板对峙法和无菌滤液法 定向筛选出对黄瓜炭疽病菌有拮抗活性的菌株ZH-9 。结果显示ZH-9 无菌发酵液对黄 瓜炭疽病的抑菌率达74.28% 。且ZH-9 对5 种不同的病原菌的抑菌带宽均7.50mm， 因此ZH-9 也有优异的广谱生物活性。 对ZH-9 进行了鉴定。结合形态学、理化特征分析及分子生物学对菌株ZH-9 鉴定。 结果表明 ZH-9 的形态学特征和理化特性与芽孢杆菌模式菌株基本一致，再结合 16S rDNA 序列分子生物学分析，鉴定菌株 ZH-9 为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus) 。 为了提高 ZH-9 的生物活性，本研究结合单因素变量分析和多因素变量正交试验 的方法得到了ZH-9 的最佳发酵培养基组分和最佳发酵条件。结果发现，最佳培养基 各组分（碳源、氮源、微量元素）及配比分别为 1.5% 可溶性淀粉，1% 酵母浸粉， 0.2% K HPO ，0.15% MgCl 。最佳培养条件分别为：pH 为7，温度32 ℃，转速200r/min ， 2 4 2 9 培养时间为36h 。优化后的ZH-9 发酵液的OD600 为 1.54，活菌量为3.0×10 cfu/mL 。 8 而未进行优化的ZH-9 菌株发酵液OD600 值为0.83，活菌量为5×10 cfu/mL 。表明优化 效果显著。因此经过对ZH-9 发酵条件优化，提高了ZH-9 菌株的活菌量以及对黄瓜炭 疽病的拮抗活性。 测定了经发酵优化后的 ZH-9 发酵液在温室条件和大田条件下对黄瓜炭疽病的防 治效果，再次证明ZH-9 对黄瓜炭疽病有抑制效果。温室盆栽结果表明：ZH-9 的保护 效果和治疗效果分别为72.69%和65.94%，保护效果大于治疗效果，在施用时间方面， ZH-9 适宜于发病前施用，ZH-9 发酵液对黄瓜炭疽病有较好的预防能力。大田试验下 的防效试验结果表明：ZH-9 的大田试验防效达到了60.34%，证明其在大田条件下对 I 摘要 黄瓜炭疽病同样具有拮抗活性，能够控制病情蔓延。因此ZH-9 能够作为黄瓜炭疽病 的生物防治材料，ZH-9 菌株有良好的应用潜力。 本文从采集秦岭森林土样开始，经过分离纯化、拮抗菌株筛选及鉴定、再经过发 酵培养基和培养条件的优化、并测定ZH -9 发酵液对黄瓜炭疽病的实际防治效果。得 到了对黄瓜炭疽病有良好防效的甲基营养型芽孢杆菌ZH-9，对该病害的绿色防治有着 现实意义。 关键词：甲基营养型芽孢杆菌；炭疽病；筛选鉴定；发酵优化；防效测定 II 目 录