计算病毒浓度.docVIP

紫外分光光度法测定提纯病毒的浓度 一、目的 由核蛋白组成的病毒有特有的紫外吸收峰，通过紫外分光光度计使用，掌握其测定原理、操作方法及病毒纯度与定量的方法。 二、主要仪器、用具及药剂 紫外分光光度计、石英比色皿、移液管、吸管、试管、缓冲液、镜头纸。 三、实验材料 TMV或CMV等病毒提纯样品悬浮液。 四、实验步骤 １．准备好提纯品及参比溶液，倒入石英比色杯。  ２．打开稳压电源及751分光光度计，将比色杯装入样品槽。  ３．按附录操作程序使用紫外光测量样品在波长260nm及280nm处的光吸收值(以A或OD值表示)记录数值。  ４．每种病毒的蛋白与核酸含量有固定比例( 附表) ，用本次试验吸收光谱比值(A260/A280)与标准比值比较。 ５．用A260值计算病毒的浓度及产量。 病毒浓度(mg/ml)=A260X稀释倍数／E0.1%1cm260nm， E为消光系数，即在波长260nm时，浓度为0 ·1％(1mg/ml)的悬浮液，光程为1cm时的光(光密度)吸收值。对已知病毒可以从附表中查到； 对未知病毒要想定量病毒，先把病毒纯品干燥称重，配成已知浓度的病毒悬液，在260nm下测其光密度，并折算成E0.1% 1cm。 病毒产量(mg/kg)＝浓度X提纯总ml数X1000/组织重(g) [注意：测量时所用测量杯的宽度应是1cm，若杯宽为0.5cm，则所得光密度值应乘以2] 。由于光散射的影响，所测定的光密度大于病毒实际上的吸收光密度，因而存在误差。因此，准确测定常常对测定的光密度进行校正(见附录)。 附表：几种植物病毒的消光系数(E值)和A260/A280值 病毒种类 E0.1%1cm260nm A260/A280 (TMV) 3 1 1 19  烟草花叶病毒 · ·  (CMV) 5 0 1 65  黄瓜花叶病毒 · ·  (TYMV) 9 6 1 51  芜青黄色花叶病毒 · ·  Y (PVY) 2 8 1 28  马铃薯 病毒 · ·  X (PVX) 2 97 1 19  马铃薯 病毒 · ·  (TNV) 5 6 1 70  烟草坏死病毒 · ·  (TRV) 3 0 1 88  烟草脆裂病毒 · ·  (TEV) 2 4 1 27  烟草蚀纹病毒 · ·  (TRSV) 12 8  烟草环斑病毒 ·  S (PVS) 3 0  马铃薯 病毒 ·