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原代细胞的分离与培养 1. 实验原理 原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时 间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指 成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二 倍体数。但实际上，通常把第 1 代至第 10 代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 体外将动物某组织，经酶法或机械处理法分离成单细胞，并在合适的培养基中筛选出特 定细胞，使得目的细胞得以生存、生长和繁殖，称为原代细胞分离。分离所得的细胞要经过 鉴定才可用于实验。解螺旋 / 2. 实验目的 分离获得原代细胞 3. 实验材料 2.1 主要试剂 新鲜组织、培养基、血清、胰蛋白酶、生长因子等 2.2 主要仪器 仪器名称 来源 型号 生物安全柜 苏净安泰 BSC-B000IIA2 二氧化碳培养箱 Thermo 311 离心机 上海卢湘仪公司 TP25-ws 显微镜 Olympus CKX41 酶标仪 Epoch 波长 595 nm 4. 实验步骤 4.1 部分干细胞，如骨髓间充质干细胞，推荐购买，原代不好养，鉴定也不易。 4.2 全骨髓贴壁法分离培养 BMSC （骨髓基质干细胞）及成骨诱导分化[11] 4.2.1 细胞分离 1. 在 1.5 月大组的 4 组大鼠中每组随机挑选 2 只进行骨髓间充质干细胞提取实验。在处 死大鼠后，将大鼠浸泡于 75%乙醇中约 10-15min。 2. 在超净台内无菌条件下迅速取出双侧股骨，浸泡在无菌 PBS 中。用含有500u/ml 青链霉 素的PBS 冲洗股骨 3 遍。 解螺旋 / 3. 去掉股骨两侧的骨骺端，暴露骨髓腔，用 5ml 注射器吸取 5ml 细胞培养液，将针头插入 一侧骨髓腔，用细胞培养液冲洗骨髓腔，冲洗液收集在一 60 mm 细胞培养皿内，之后再用注 射器吸取冲洗液，将针头插入另一侧骨髓腔冲洗，如此反复数次，直至绝大部分骨髓被冲出 为止。此时所得冲洗液即为股骨骨髓细胞悬液。 4. 用注射器小心吸吹细胞悬液数次，将细胞充分混勾。取 20 ml 细胞悬液，加入 180 ul 生理盐水，之后抽取 20ul 滴入细胞计数板内，计算细胞浓度，之后调整接种密度，要求最 终接种密度在 2 – 8 x 106 范围内。 5. 将培养皿放置在细胞培养箱（37.5℃，5% CO ）内常规培养。48 小时后半量更换细胞培 2 养基，之后每 72 小时全量更换细胞培养基，直至细胞铺满约 80%培养皿，此时所得贴壁细 胞即为骨髓间充质干细胞。 4.2.2 细胞传代 细胞传代：小心吸出细胞培养液，用 PBS 冲洗细胞 2 次，之后加入 0.25%胰蛋白酶溶液 3ml，消化细胞 3 分钟，显微镜下观察细胞，至细胞之间不再连接成片、多数细胞胞质回缩。 吸弃胰蛋白酶溶液，加入细胞培养液，用移液管将已消化的细胞吹打成细胞悬液。吸取细胞 悬液，加入 20ml 离心管内，配平后放入离心机，3000 rpm 离心 8 分钟。弃掉上清液，加入 2ml 培养液，用移液管吹打细胞制成细胞悬液。取 20 ul 细胞悬液滴入细胞计数器，计算细 胞浓度。向细胞悬液内加入细胞培养液，至细胞浓度约为 5 x 104。之后将细胞接种于24 孔 板内，放置在细胞培养箱（37.5℃，5%CO ）内常规培养。每 72 小时全量更换细胞培养液。 2 4.2.3 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化 1. 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化：待细胞在 24 孔板内铺满约 80%后，弃去原培养液， 加入大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养液（配方：ＳＤ大鼠骨髓间充质干细胞培养液 + 25pg/ml 抗坏血酸 + 5 mM β－甘油磷酸钠 + 100 nM 地塞米松）诱导细胞成骨分化，之