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抗原抗体知识 抗原 (antigen, Ag) ¨ 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和 ( 或 ) 细胞免疫反应的物质 ,称为抗原。抗原具有两个方面的特性 : –免疫原性 :引起机体产生抗体和 (或 ) 致敏淋细胞的特性 ; –免疫反应性 :抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特 性。 ¨ 根据抗原是否显示免疫原性分为: –完全抗原 :分子量较大 ,一般在 10kDa 以上 ,并具有较复杂的化学组成。 ? 免疫原性最强的是蛋白质抗原 , 多糖次之 ; 脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形 成复合物才具有良好的免疫原性。 –半抗原 :又称为不完全抗原 ,分子量较小。例如 :某些短肽、多糖、类脂和药 物 等。 半抗原必需与载体结合 ,才能获得免疫原性。载 体 ¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物质, 具有将免疫原性传递给偶联的半抗原 能力。 –常用的载体有钥孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 、牛血清 白蛋 白 (bovine serum albumin, BSA) 、卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA) 等。 –用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团 -NH2 、 -COOH 等将半抗 原结 合到载体上。结合比例为 5kDa 结合 5~25 个分子的小肽。 (三 )抗体 (antibody, Ab) 1、抗体的概念 : ¨ 机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合 的球蛋白 ,被称为抗体。 –抗体主要存在于血清内 ; –抗体都是免疫球蛋白 ,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。–免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种 ,既 IgG 、 IgD 、 IgE 、 IgA 、 IgM 。 2、免疫组化实验中常用的抗体 :单克隆抗体和多克隆抗体。 ¨ 单克隆抗体:是一个 B 淋巴细胞克隆分泌的抗体 ,是应用细胞融合杂交瘤技 术免疫动物制备的。 –特异性强、抗体产量高。 ¨ 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后 , 从动物血中所获得的免疫血 清 ,是多个 B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。–特异性低 ,会产生抗体的交叉反应。–多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片 ,可减少假阴性染色机会。–抗原与抗体的结合 , 要求量保持一定比例 , 当抗原或抗体过量时 , 是不能聚合 成大颗粒。 3、抗体的制备 —— 多克隆抗体的制备 ¨ 动物的选择 ¨ 佐剂(adjuvant) ¨ 免疫方法 ¨ 免疫剂量 ¨ 抗体效价的测定 ¨ 放血或定期抽血 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于 : ¨ 所需抗血清的量 –小鼠只能提供 1.0~1.5ml 的血液 ,而山羊能提供几升。 ¨ 能供免疫用的抗原量 –小鼠 50mg 足够 ,而山羊需要几毫克。 动物的选择 ( 续 ) ¨ 动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。–例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。–常用的动物有兔、羊、马、猪等 ,以兔 (新西兰兔 ,年轻 ,健壮 ,体重在 2.5kg 左 右 ,雄性 ) 为最常用。 佐剂 (adjuvant) ¨ 一般可溶性抗原注射后, 迅速从注射部位扩散、 吸收代谢。 佐剂可延长潴留时 间, 且延长免疫刺激作用。 因此在制备抗体的过程中 , 常将抗原和佐剂一起注 射。 ¨ 最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为 : –弗氏不完全佐剂 (Freunds incomplete adjuvant) –弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant) 弗氏不完全佐剂 (Freunds incomplete adjuvant, FIA) ¨ 是由油剂(石蜡油或植物油 ) 与乳化剂 (羊毛脂或 Tween80) 混合而成 ,比例 为 1:1 、 2:1 、 3:1 或 5:1, 可根据需要而定 ,通常 2:1 。 使用时与水溶性抗原按1:1 比例充分混合 , 使抗原分散在佐剂中形成油包水 乳 剂。 弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA) ¨ 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌 (终浓度为 2~ 20mg/ml), 即成为 FCA 。 ¨ 免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后 (油包水 ) 注入动物。–一般首次注射时用完全佐剂乳化 , 第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用 佐剂。 佐剂与抗原乳化的方法 ¨ 研磨法:适于制备大量的佐剂抗原 –先将不完全佐剂加热 , 取 1.73ml 放人无菌玻璃研钵内 ; 缓缓滴入 0.23ml 活卡 介苗 ,边滴边按同一方向研磨 ,使菌体完全分散。 –按同样方法滴人抗原 , 每加一滴应研磨至小滴消失。 滴加抗原