如何构建质粒克隆.pptxVIP

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2020-09-28 发布于上海
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如何构建质粒克隆.pptx

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如何构建质粒克隆;;MCS 多克隆位点;pCMVSPORT6 MCS;构建过程;第一步：设计目的基因PCR引物目的：1）通过PCR方法扩增目的基因2）在目的基因片断两端增加酶加位点;设计引物前需解决的问题;PEGFP MCS;BAX insert sequence;enzyme;AGATCT ---- BglⅡ buffer 3 GAATTC ----EcoR I buffer 3 ;酶切位点保护碱基;设计引物原则;cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length ---21, GC%---71.8%, Tm---71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG (length ---25, GC%---52%, Tm---68.4);引物中是否应包含终止密码子？;加入保护碱基及酶切位点;★ MCS与荧光相连的地方应特别注意有无移码;荧光表达在前时(EGFP);荧光表达在后时 (DsRed);荧光表达在后时需加KOZAK 序列;Primer final;33.5 uL dH2O 10 uL phusion HF buffer 1 uL dNTP(10mM) 2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO 0.5uL phusion polymerase 50 uL ;Buffer3 : 2ul vector: 4ul 100%BSA: 0.2ul EcoR Ⅰ: 1ul BglⅡ: 2ul ddH2O: 10.8ul ;第四步：琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收;Buffer3 : 2ul BAX: 15ul 100%BSA: 0.2ul EcoR Ⅰ: 0.5ul BglⅡ: 1ul ddH2O: 1.3ul;第六步：回收效率验证;T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax: 3ul vector: 1ul ddH2O: 13ul;第七步：转化;第八步：验证 (1);第八步：验证 (2);第八步：验证 (3);谢谢，敬请批评指正！;克隆连接