Modfit分析细胞周期指南.pptxVIP

学 海 无 涯 Modfit 分析细胞周期指南 本指南只提供在 guava 流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据，其它请参阅 产品使用说明书，本指南仅供参考。 一．概述 细胞周期的概念：细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束，都要经历相同的变化阶段(即 G1→S→G2→M )周而复始地进行活动，细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)。尽管在各种细胞中各期 所占时间都不尽相同，但相对而言M 期最短，S 期却较长。 分裂间期： 1 、G1 期 ，前一次有丝分裂完成到 S 期开始。各种与 DNA 复制有关的酶明显增多，线粒 体、叶绿体、核糖体增多，内质网在更新扩大，高尔基体、溶酶体都增加，中心粒彼此分离、 复制。 2、S 期：DNA、组蛋白合成 3、G2 期， S 期结束后到有丝分裂开始。由上可以看出 G2 期 、S 期、M 期反映了细胞的 增殖活性，特别是G2 期 、S 期（因M 期较短）。因而，G2/M％+S％反映了细胞增殖能力。 二者有无差别要进行统计检验。 细胞周期阻滞：对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞)，由于细胞不断的增殖， 细 胞总是处于从 G1 、S、G2 和 M 期的连续的细胞周期中。 在细胞周期的各阶段， 细胞分 别进行着 DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。每一阶段都是下一阶段的 准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生化事件， 这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的能 力，而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。只有前一阶段的生理活动完成后，才 能通过称为检定点的阶段，进入周期的下一步，一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细 胞周期前进的因子，从而使细胞周期停滞在检定点， 这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。 比较相应的细胞 G1 、S、G2 期差异有无统计学意义，才能说有无细胞周期阻滞。;学 海 无 涯 下降了。 细胞周期是基于细胞处于不同分裂时期具有不同的 DNA 含量而分析细胞处于不同的时期的 方法。确切的说结果中 G1 期的百分比实际上是 G1＋G0 期细胞??百分比。 G2 的百分比实 际上是 G2＋M 期细胞的百分比。 二．细胞样品制备 在样品的制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，虽然细胞通透剂种类很多，但用于碘 化丙啶（PI）染色进行细胞周期和倍体分析的细胞通透剂，通常为 70％冷乙醇；乙醇必须与 细胞充分快速混匀，避免细胞聚集成团；乙醇必须与细胞充分快速混匀，避免细胞聚集成团； 流式细胞仪获取细胞的速度不宜太快，在 guava 上要使用最低速。 用户首先使用 guava 的细胞周期试剂盒，并按相应的操作步骤进行细胞固定、染色后， 使用 guava 的细胞周期模块进行数据采集和分析，并生成以.ccy.CCY.FCS 为后缀的文件。 细胞周期结果受样品制备的影响较大，请参阅相关文献进行样品制备。 guava 细胞周期试剂盒简要操作步骤： 制备 70%的冰乙醇, -20C 预冷 2 小时 制备单细胞悬液,收集细胞,离心去除培液,用 PBS 重悬 离心,去除 PBS. 加入 100ulPBS 重悬. 将 100ulPBS 逐滴加入 7ml70%的冰乙醇中固定过夜 固定后,450g 离心 5 分钟,弃固定液,用 3mLPBS 重悬. 再次离心, 弃PBS,留细胞在离心管底部, 加入 500ul Cell Cycle 试剂 染色 30 分钟后上机检测. 请注意在固定步骤中，加入－20℃70%酒精（1 到 2ml）打匀，固定，至少半个小时以上 （约 100ul 细胞用枪一滴一滴加入到 7ml 装有预冷 70%冰乙醇（-20 至少 2 小时）中，每加 一次都需要反复吹打，以避免细胞成团；需要注意的就是加酒精固定的时候要用 4℃预冷的 酒精，缓慢的加，边加边晃动细胞，避免细胞黏连在一起。），（不做的话，可放入 4℃冰箱 保存 2-3 周问题不大。）另在用预冷 PBS 洗去固定剂时，不宜洗得过多，以免细胞损失。 三．Modfit 操作指南 1. 双击 Modfit 图标，打开Modfit 软件（无需安装），打开界面如下：;学 海 无 涯 ;学 海 无 涯 ;学 海 无 涯 ;学 海 无 涯 ;学 海 无 涯 8. 在下述界面中左侧（X Parameter）选第六个参数（FL2-W-PM2Width），右侧（Y Parameter） 选择第五个参数（FL2-P-PM2Max），点击 OK 继续：;学 海 无 涯 ;学 海 无 涯 11. 软件会出现设门