细胞油红O染色地操作步骤.docxVIP

细胞油红 O 染色的操作步骤 点击次数： 348 发布时间： 2011-4-1 1、 10%中性甲醛的配制 材料：中性甲醛 ( 多聚甲醛 ) 密封瓶 称取 1g 中性甲醛粉末，加入 10ml 的三蒸水中，密封，在 60 度水浴中过夜才能溶解。 配好的溶液 1 个星期内有效，最好 4 度保存。 2、染色液 的配制 材料：油红染料 棕色可密封瓶 异丙醇 研钵 漏斗 定性滤纸 称取预先研磨粉碎的 0.5g 油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至 100ml，棕 色瓶密封 ( 或锡箔纸包裹避光 )4 ℃保存，为储存液，可长期保存。用时取 6ml 加三蒸水 4ml 混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。 3、培养载体 3 毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品， hoechst33342 染核的话，塑 料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。 4、 . 染色对象 间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。 5、注意事项： 脂肪油红染色，有的是动物 / 人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是 各论坛方法小结，不全。 (1). 完全成熟饱满的脂肪 细胞 ，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这 个问题。 (2). 细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。 (3). 如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。 6、染色步骤： 先小心轻缓倒去培养夜。 用 pbs 轻缓漂洗 ( 不洗没问题 ) 。 (3) 加 10%中性甲醛固定 30min( 实际固定时间过夜都没问题。固定液用 95%酒精也可 ) 。 固定的是细胞膜。 (4) 稀释油红储存液，油红：去离子水＝ 3:2 ，滤纸过滤，室温放置 10min( 除去一些 杂质， 染色结果更清晰 ) 。 (5) 染色 10min 左右，加的体积覆盖住板底即可， 如 6 孔加 1.5ml ，24 孔加 0.5-1ml( 实 际染色时间 1 小时都可以 ) 。 脱色，用 75%酒精 /60%异丙醇漂洗，除去多余的染料 ( 实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少 ) 。 复染，淡苏木染色 1/5 分钟， pbs 漂洗 ( 这一步不做也可，看试验需要，并且苏木 素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342 也可以，浓度 5 微克 / 毫升染 10 分钟 即可把核染上 ) 。 甘油明胶封片 ( 封片后可长期保存 ) 。 显微镜观察。 三、显示脂类的油红法： （1 ）操作步骤： 1 、福尔马林固定后的恒冷箱切片附贴于载片上或游离切片，厚 5-10nm ， 2 、60% 异丙醇稍洗切片， 3 、油红 O 液染 5-15min ， 4 、60% 异丙醇洗去多余染液， 、自来水洗， 、苏木素染细胞核 2min ， 、自来水洗，如果需要可分化， 、水洗至细胞核蓝化 5-10min ， 、擦去多余水分，甘油明胶封固。 结果：脂类物质显示红色，细胞核显示蓝色。 （II  ）试剂的配制： 油红  o （ oil red o  ）  0.5g 异丙醇（  isopropanot  ）  100ml 将异丙醇放入三角烧瓶，再加入油红 O，于水浴中慢慢加热使之溶解，待至完全溶解 后取出，冷却至室温后，过滤，装于棕色小磨沙口瓶保存，临用前取 6ml 加蒸馏水 4ml 混合后静置 10min 后过滤，染色时间 5-15min 。  ，