沉默Fibulin-5对lgG4-ROD泪腺成纤维细胞增殖与凋亡的影响.pdfVIP

摘要 目的：以病理确诊IgG4 相关性眼疾病(IgG4-related ocular disease，IgG4-ROD)的泪腺为研究对 象，取材培养原代成纤维细胞，应用RNAi(RNA interference，RNAi)技术沉默Fibulin-5 基因，使 目标基因Fibulin-5 的mRNA 及其蛋白表达量下调后，观察成纤维细胞的凋亡情况，探索抑制泪腺纤 维化的方法。 方法：选取2018 年10 月至2019 年8 月到我科住院手术治疗并符合IgG4-ROD 诊断标准的患者6 例， 取已经发生部分或完全纤维化的病变泪腺，使用0.2%的Ⅱ型胶原酶法进行泪腺成纤维细胞原代培养。 遵循小干扰 RNA （Small interference RNA，siRNA）设计原则，由上海优宁维生物公司针对人 Fibulin-5 基因序列特征，设计高效且具有特异性的Fibulin-5 siRNA(L1-3)。将获得的三条siRNA 分别转染第 4 代 IgG4-ROD 泪腺成纤维细胞，设置 6 组，其中 A 组为空白组、B 组只加 lipofectamine 2000，C 组为阴性siRNA，D 组为Fibulin5-siRNA-1，E 组为Fibulin5-siRNA-2，F 组为Fibulin5-siRNA-3。分析各组细胞中Fibulin-5 mRNA 表达量差异，以筛选出最优的siRNA。将 最优的siRNA 再交由上海优宁维生物公司构建Fibulin-5 siRNA 载体质粒，将获得的siRNA 质粒设 置4 个浓度（0、25、50 和75nM），不同浓度siRNA 转染成纤维细胞后，应用CCK-8 法测定其抑制 率，选出合适的浓度作为后续实验的siRNA 浓度。再将第4 代泪腺成纤维细胞分为四组，设置三组 对照组（Ⅰ组为空白对照、Ⅱ组为空载体对照、Ⅲ组为阴性siRNA 对照）以及siRNA 转染组（Ⅳ组）， 于 72h 后收集细胞并提取细胞中总mRNA，分析各组细胞中Fibulin-5 mRNA 的相对表达量的差异， 验证细胞基因下调情况；应用Western Blot 检测基质蛋白Fibulin-5 的表达，验证目标蛋白下调情 况；于siRNA 转染后的24h、48h 及72h，收集细胞，应用流式细胞仪测定各组成纤维细胞的凋亡率。 结果：1、细胞鉴定：人IgG4-ROD 的泪腺在0.2%Ⅱ型胶原酶消化法下可以成功培养出原代细胞，经 免疫荧光法鉴定证实为成纤维细胞。2、最优siRNA 筛选：以2-△△Ct 值表示各组细胞Fibulin-5 mRNA 相对表达量，发现三条 siRNA 序列中编号为Fibulin-5 siRNA-1 的序列是最优siRNA，可以有效地 使人IgG4-ROD 泪腺成纤维细胞Fibulin-5 基因的表达减少。3、细胞增殖活性：以Fibulin-5 siRNA 浓度为 0nM 作为空白对照，在转染后的 24h，四组细胞增殖率间的差异无统计学意义（P0.05）； 在Fibulin-5 siRNA转染的48h和72h后，Ⅰ组细胞成纤维细胞的增殖率明显高于siRNA浓度为25nM、 50nM 及 75nM 的各组细胞，差异具有统计学意义（P0.05），且随着转染的siRNA 浓度升高，增殖 率越低；浓度为75nM siRNA 的抑制作用最为明显，细胞增殖明显受到抑制。4、Fibulin-5 mRNA 检 测：Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组细胞之间的Fibulin-5 mRNA 相对表达量差异无显著性意义（P0.05）；但Fibulin-5 siRNA 转染组细胞的Fibulin-5 mRNA 的相对表达量低于Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组细胞，目标基因的表达量明显 下降。5、Fibulin-5 蛋白检测：Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组细胞之间 Fibulin-5 蛋白表达的差异无统计学意义 （P0.05），但Fibulin-5 siRNA 转染组细胞Fibulin-5 蛋白的表达低于Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组细胞，基质 蛋白Fibulin-5 的表达明显下降。 6、凋亡率：在转染后的24h、48h 或72h，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组细胞凋 亡率之间无明显差异，Fibulin-5 siRNA 转染组较Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组的细胞，其凋亡率明显升高，具有 显著差异（P0.05）。 结论：1、IgG4-ROD 泪腺经过原代细胞培养后，并对细胞进行鉴定，证实为成纤维细胞。 II 2、筛选出特异性的Fibulin-5 siRNA，并成功的构建了Fibulin-5 siRNA 重组质粒，在