蛋白表达步骤.pdfVIP

1．培养基的配制 原理 步骤 LB 培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠 杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生 素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养 基的名称被广泛解释为 Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝 尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth ，即溶菌肉汤。 LB 培养基的配制： 成分 胰蛋白胨(tryptone) 10g 酵母提取物(yeast extract) 5g 氯化钠(NaCl) 10g 固体培养基另 琼脂粉 15-20g 加双蒸水至 1000mL, 用 5mol/L NaOH （约0.2ml）调pH 至7.2，121 ℃灭菌 30min 配制方法 　　（ 1）称量 分别称取所需量的胰化蛋白胨、酵母提取物和 NaCl ，置于烧杯中。 　　（2）溶化 加入所需水量 2/3 的蒸馏水于烧杯中，用玻棒搅拌， 使 品全部溶化。 　　（3）调 pH 用 1mol/L NaOH 溶液调 pH 至 7.2。 　　（4）定容 将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。 　　（5） 琼脂 加入所需量琼脂， 热融化，补足失水。 　　（6）分装、加塞、包扎。 　　（7）高压蒸汽灭菌 100Pa 灭菌 20min。 2、大肠杆菌菌种活化 原理 　　菌种的活化就是将处于保藏状态的菌种放入合适的培养基中 进行培养，逐级增大培养是为了得到纯而壮的培养物，可以理解为就 是为了获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物进行培养。菌种发酵 一般情况下需要 2-3 代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时 的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境 　　中药标准对照品研究中心建议实验要明白菌种活化的情况就 首选需要了解菌种保藏的方式和方法。目前国际和国内常用的菌种保 存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、 80℃ 冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。 　　对于不同的保存方式活化的方式也不同： 　　 1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可； 　　2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适 宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次； 　　3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取 部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙 土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面； 　　4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用 70%酒精棉花擦 拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热， 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈， 顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的 顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上， 进行适温培养； 　　5 -80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管 或塑料冻存管，应立即放置 38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇 动。直到内部结冰全部溶解为止，约需 50 秒-100 秒。开启安瓿管或塑 料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养 　　6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃ 冰箱冻结法保存 菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在 38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止， 一般约需 50 秒-100 秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜 的培养基上进行培养。 步骤 　　总结一下菌种活化需要以下几个步骤： 　　第一配置菌种适宜生长的培养基 　　第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种 解冻 　　第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤 称为菌种复壮 　　第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑