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人粒细胞无形体病实验室检测方案（试行） 为保证及时、科学地采集、运送人粒细胞无形体病病例 （包括疑似病例）及疫源地调查的各种类型标本，规范人粒 细胞无形体病的实验室检测程序，提高检测质量，为明确诊 断或开展相关的科学研究提供实验室依据，特制定本方案。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 一、 样本采集对象 （一） 人粒细胞无形体病病例（包括疑似病例，以下 同）。 （二） 病例密切接触者或其他健康人群。 （三） 疫源地可疑宿主动物（野生动物及狗、羊、牛 等家畜）、媒介蜱。 二、 标本种类及采集方法 （一） 抗凝血。 常用EDTA抗凝管或枸橼酸盐抗凝管采集血液 5ml，用于 病原分离。应尽可能在病人使用抗生素前进行血液的采集。 （二） 非抗凝血。 用无菌真空管，采集病例、健康人群及宿主动物非抗凝 血5ml，用于血清抗体及 PCR检测。采集后，应及时分离血 清，将血清、血球分别保存。急性期抗体及 PCR检测用血液该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 采集尽可能在发病后1周内，恢复期抗体检测标本采集至少 间隔2-3周。如第2份血清在1个月之内抗体升高不明显的， 应建议间隔2-4周后米集第3份血液标本。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 （三） 包涵体检测血涂片的制备。 采集血液标本后，制作厚血片，进行红细胞裂解处理等。 （四） 媒介蜱标本的米集。 采集动物体表媒介蜱，用镊子夹取，放入铺垫有潮湿滤 纸或纱布的青霉素小瓶或试管中，用纱布包紧瓶口以防止蜱 爬出。实验室接到蜱标本后，首先应进行种属鉴定，然后按 类别分组（1-5只蜱/组），采用75%酉精浸泡30min后，用 无菌蒸馏水反复冲洗 3次。最后进行分组研磨，研磨液用于 提取DNA进行PCR扩增。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 （五） 有条件时，可采集活检或尸检标本，冰冻、福尔 马林固定或石蜡包埋后进行实验室检测。具体方法参照病理 实验室相关要求和卫生部《传染病人或疑似传染病人尸体解 剖查验规定》的相关要求。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 三、标本采集和保存注意事项 标本采集应符合无菌操作要求。抗凝血如不能立即床边 接种，应置于4C环境保存，避免冰冻（不超过 2周）。非该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 抗凝血应及时进行无菌分离血清，血清用于抗体检测，血球 部分研磨后提取 DNA用于PCR检测。如不能及时检测，可暂 置于-20C环境保存。所有标本应置入大小适合、 带螺旋盖、 内有垫圈的冻存管内，拧紧管口。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 标本采集后，应认真填写采样登记表 四、实验室检测 （一）包涵体的检测。 血片及白细胞涂片制备 采集的抗凝血标本尽快用血球层推血片，待干燥后冷丙 酮固定10min ;或提取抗凝血中的白细胞并进行涂片，待干 燥后冷丙酮固定10min。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 染色 通常采用瑞氏（Wright ）染色法、姬氏染色法及瑞—姬 混合染色法。有条件的实验室，可使用美国 CDC推荐的染色该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 方法。 染液配置方法 （1） 瑞—姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各 g，以甲 醇研溶，加甲醇500ml保存，每天摇匀1次，1周后可使用。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 （2） 改良Me Donald法瑞一姬染色剂： 75 ml甘油（分 析纯）中加入磷酸盐缓冲液（ Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g , 以4 ml蒸馏水溶解，37 C水浴24 h溶解混匀，用滤纸过 滤，保存于密圭寸的棕色瓶中备用。上述甘油缓冲液 ml加瑞 —姬染色剂50 ml，混匀后备用。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 染色步骤 血推片或白细胞涂片分别以两种染色剂染色 2 min，再 加蒸馏水作用5 min，用自来水冲洗。 结果观察 存相关标本，以便进行复核。 （二） 血清学检测。 常用血清学方法为间接免疫荧光（IFA ）法。采集急性 期（发热初期，一般发病 1周内）与恢复期（至少间隔 2-3 周）双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采 集第3份血液样本（间隔 2-4周）。该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 试剂 使用国际推荐的、经过ISO质量认证的产品。 方法及操作按说明书进行。 结果解释 IFA检测结果解释按说明书进行。 如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强 烈支持嗜吞噬细胞无形体感染。如果急性期抗体升高，而恢 复期没有升高或轻微升高，则应采集第 3份血液样本（间隔该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠 2-4周）进行进一步检测。 （三） 嗜粒细胞无形体核酸 PCR佥测。 目前