细胞工程--C4.5-细胞的冻存、复苏和运输.pptVIP

第四章 细胞培养 细胞培养 4.1 培养细胞的生物学特征 4.2 细胞培养液 4.3 细胞的基本培养技术 4.4 细胞系和细胞株的建立 4.5 细胞的冻存、复苏和运输 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 预先配制冻存液： 含20%血清培养基10%DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干细胞的研究证 细胞复苏方法 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 低速离心10分钟。 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 细胞运送 当前培养细胞既可在国内相互寄赠，也可进行国际间的交流，为此要有运输细胞的方法。 装运方法有两种: 一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦; 二为充液法，比较简便,装运过程如下： 1.选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落; 2.妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响; 3.到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。 细胞培养的优缺点 优点： 1. 可简化细胞的生长环境。 2. 能够方便地控制实验因素。 3. 易于观测实验结果。 4. 可供研究的细胞种类极其广泛。 5. 可同时提供大量均一性较好的细胞群，降低实验成本。 6. 能够进行大规模生物制品的生产。 缺点： 1. 体外培养的动物细胞对营养的要求较高。 2. 动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。 3. 体外培养的细胞与体内生长的细胞存在或多或少的差异。