第十三章-生化药物制造工艺--核酸类药物.pptxVIP

第三节 核酸类药物 ?一、核酸类药物概述 核酸类药物可分为两大类，一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡。 第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一些品种： ; 随着分子生物学和遗传工程的发展，基因治疗应运而生，得到广泛的肯定。其中包括反义核酸技术，简称反义技术。利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。 反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点： ① 有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设计合理特异性的反义核酸比较容易； ② 反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合从而调节基因的表达。; 它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内、而一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。 核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。 核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫。 DNA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途径。 ;二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产 （一）RNA与DNA的提取与制备 1、 RNA的提取与制备 （l）工业用RNA的提取 ① RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体。 通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。; 在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高??易于提取RNA。 很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。 ② 高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。 ③ 工业废水培养高含量RNA酵母 RNA的提取的方法：; 稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和pH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。 此法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持3~4h破坏酶)。 浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。 要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。 ; 脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。 ④ RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80％）。 ;;2、DNA的提取与制备 （1）工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。 如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA 50％～60％。;2、具有生物活性DNA的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟。将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心