《第五章固定化酶及固定化技术》.ppt

第五章 固定化酶及固定化技术;酶：;固定酶具有催化活性;结果如图所示: 固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15% ,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性;一、固定化酶（immobilized enzyme）;固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。 酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。 ;与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器;简 史;1973年，固定化微生物的应用——固定化大肠杆菌中的天冬???酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸 1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 1978年，日本用固定化细胞生产酶——固定化枯草杆菌生产淀粉酶 1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究 1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸 1986年，郭勇等人固定化原生质研究;二、固定化酶的优缺点：;缺点：;三、固定化酶制备;固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。 固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。;酶的固定化方法; —— 指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。 优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象 较少或者不变化；载体廉价易得 缺点：结合力弱，易解吸附 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。;2. 结合法; 使用注意：pH、离子强度、温度 离子结合法的操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。 但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。; 这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。 归纳起来有二类： 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。 在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。(与交联法合用）;酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。;可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体 ;首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键 ;酶分子和载体连接的功能基团： 酶蛋白N-端的α-氨基或赖氨酸残基的氨基 酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的?-和γ-羧基 Cys残基的巯基 Ser、Tyr、Thr残基的羟基 Phe、Tyr残基的苯环 His残基的咪唑基 Trp残基的吲哚基;A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法;共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比：;3.交联法;戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。;;;酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子:（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶;4.包埋法;网格法 ——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。;微囊型;微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。 ;酶的固定化模式;各类固定化方法的特点比较: ;没有一个方法是十全十美的 包埋、共价结合、共价交联三种虽结合力强、但不能再生、回收； 吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差，在受到离子强度、pH变化影响后，酶会从载体上游离下来。 包埋法各方面较好，但不适于大分子底物和产物。;其他固定化酶方法;判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有:  ? (1)相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值 通常高于75%? ?? (2)酶的活力回收率 固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。 一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,