第八章 细胞重组与克隆技术.ppt

第八章 细胞重组(又叫细胞拆合) 是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 从原生动物等低等生物的去精细胞或互换细胞核的细胞，可以清楚看出真核细胞的细胞核与细胞质是相互配套、精确平衡的。 例如，将变形虫切成两个半，一半有核、一半无核；无核的一半虽然仍能消化已经吞噬的食物．但不能重新摄取食物、对外界刺激也不再发出反应。 同位素示踪法证明，这无核的一半虽仍能吸收和结合无机磷，但其吸收和结合率均呈直线下降。 在用电镜观察时．可发现其细胞内的膜结构如高尔基体、内质网系等会出现退化。 而有核的那一半照样能够摄食，对刺激也有反应，失去的收缩泡可被补偿，还能生长并及时分裂。如果用一显微勾针将变形虫的细胞核钩出，这种变形虫的行为就会变得与无核变形虫一样，如在及时植入同种变形虫的另一个核，上述各种生命活动又会重新恢复。 在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。 如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果； 绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。 这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程 1、将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。 2、结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物。因此细胞重组技术现巳成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。 3、只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状相功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要意义。 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种 （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体 （3）胞质体与核体重组形成重组细胞 胞质体是去除细胞核后由膜包裹的无核细胞。 微细胞又可称为微核体，含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整的质膜的核质体。 胞质体和微细胞与完整细胞融合后就能产生相应的杂合体。 胞质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功的生存下去。 一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置——显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。 用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。 意义 1、实现细胞的拆合 2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。 分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括： 细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用 经常采用的细胞分离方法如下： （一）差速离心（differentialcentrifugation） 　　在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 　　由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 　　差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 经常采用的细胞分离方法如下： （二）梯度沉降分离法 主要是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。 常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液．这此介质主要有：血清、蔗糖等： （三）等密度沉降分离法 主要是根据细胞密度差异来分离细胞。 细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。 如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。