第八章高效液相色谱法.pptVIP

六 尺寸排阻(凝胶)色谱法 排阻色谱分离示意图 相对分子质量差别 大于10％的化合物 才可以分离 1 分离原理 体积排除色谱的分离机理 2 固定相 是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。 凝胶 3 流动相 不采用改变流动相组成的 方法控制分离度 凝胶色谱概述 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测 分离方法的选择 七、亲和色谱(AC) （Affinity chromatograph） 原理：利用生物大分子和 固定相表面存在的某种特 异性亲和力，进行选择性 分离。 先在载体表面键合上一 种具有一般反应性能的所 谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原 等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸 附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 第三节 液相色谱的固定相与流动相 一、液相色谱固定相 1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30～40μm的玻 璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的 多孔硅胶。 表面积小，柱容量底； 二. 化学键合相色谱 采用化学键合相的液相色谱 1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传 质快；2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱； 特点 存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主； 缺点∶ pH值不能小于3 1. 键合固定相制备 ODS(C18)键合相 硅胶 十八烷基氯硅烷 非极性 硅烷化反应 使用pH范围： 2-8 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N 键合固定相类型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等 离子交换基团 胺基、季铵盐 磺酸、羧酸 2. 键合相色谱法分类 ?反相键合相色谱: 常用固定相：C18 分离对象 非极性 中等极性化合物 常用流动相 甲醇-水 乙睛-水 反相键合相色谱 疏溶剂分离机制 固定相极性流动相极性 反相色谱最常用的流动相： 水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大 水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。 ?正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 ?离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。 例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水 出峰顺序：苯酚，甲苯 出峰顺序：甲苯，苯酚 十八烷基键合相 二醇基键合相 保留时间： 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 没食子酸 3,4-二羟基苯甲酸 固定相: 非极性; 流动相: 极性 组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸没食子酸 三、液相色谱的流动相 1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱 剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分 分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱 法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称 为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在 两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可 以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以 改进分离或调整出峰时间。 梯度洗脱的特点 ?改善分离, 加快分析速度； ?改善峰形, 减少拖尾; ?可能引起基线漂移 分配比变化范围宽的 复杂样品应采取 梯度洗脱方式分离 等度洗脱与梯度洗脱 3. 流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首