第五章-2酵母基因工程-927.ppt

（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 （二）酵母菌的宿主系统 （三） 酵母菌的载体系统 人工构建酵母质粒的共同特点： （四）酵母菌的转化系统 （五）酵母菌的表达系统 1、酿酒酵母表达系统 2、甲醇酵母表达系统 1）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 2）甲醇酵母表达系统的优缺点 3）甲醇酵母表达系统操作原理 宿主菌株与标记基因 Mut表型与甲醇利用率 甲醇酵母系统的整合事件 毕赤酵母系统 模式表达载体 ① AOX1位点插入 ② His4位点插入 ③ 多基因插入事件（串联整合） ④ 基因取代（GS115，AOX1+） 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 4）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 ① 载体稳定性 ② 基因剂量 ③ 整合位点 ⑤ mRNA 5’端 ⑦ 分泌信号 （六）利用重组酵母生产乙肝疫苗 二大宿主系统主要特点 毕赤酵母 汉逊酵母 最适温度 30℃ 37℃ 最适pH值 4.5 4.5 甘油阻遏 是 否 糖基化 部分过度 较正常 高密度发酵 100g/L 100g/L 二大宿主系统主要选择标记 宿主 选择标记 毕赤酵母 his4、G418、Zeocin、Cu2+ 汉逊酵母 leu2、his3、ura3、G418 毕赤酵母系统主要宿主菌 宿主株 特 点 Y11430 野生型、Mut+ GS115 his4- 、Mut+ KM71 his4-、aox1::ARG4(AOX1-)、Muts SMD1168 his4-、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-，Mut- Mut AOX1基因 AOX2基因 表型 Mut+ 存在 存在 正常型 Muts 缺失 存在 缓慢型 Mut- 缺失 缺失 负型 YRp型载体： 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合。 YIp型载体： 在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组； 有两种整合模式：插入、取代； 5’AOX1启动子片段含AOX1启动子，在甲醇诱导下可启动外源基因表达； MCS为外源基因的插入位点； 信号肽序列使外源蛋白分泌到发酵上清中，便于纯化； TT提供转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志，能与 酵母染色体his4基因同源重组； 3’AOX1基因片段能与酵母染色体AOX1基因同源重组； Amp为载体在E.coli中的筛选标志； f1 ori为丝状噬菌体的复制起点。 载体的3’AOX1区与酵母基因组AOX1基因的末端发生整合重组。 载体的HIS4区与酵母基因组HIS4基因的末端发生整合重组。 表达载体类型 需带入ATG 单位点 胞内表达与分泌表达载体 表达载体类型 需带入ATG 多位点 信号肽：PHO1 信号肽：MF-? pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点 载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA 5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚。 同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。 YRp型载体的稳定化： 选择-非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时、整合位点不确定。 构建高拷贝整合型表达载体。 外源基因表达存在基因剂量效应。 筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子； 采用YRp型载体稳定化技术，获高拷贝整合子； 毕赤酵母中个别情况整合于Hi