分子生物学研究方法和技术.pptVIP

4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5、??操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6、 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8、 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。 9、 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。 知识回顾Knowledge Review 1.1.2 1.1.3 三大原则 分子生物学研究的三大主要领域 分子生物学发展的大支撑学科之一 分子生物学发展的大支撑学科之二 分子生物学发展的大支撑学科之三 1.3 . 21世纪分子生物学展望 1.3.2 未来生物学形成的新热点及领域 1.3.2 未来生物学形成的新热点及领域 分子细胞生物学(Molecular Cell Biology) 1.1.4.  要获得所需PH值的1M ?Tris HCL，可通过将一定数量的10M HCL和1升Tris碱混合，如下表所示: PH，25℃ 10mol/LHCL(ml) PH 25℃ 10mol/LHCL(ml) PH 25℃ 10mol/LHCL(ml) 7.2 89.4 7.8 69.0 8.4 34.4 7.3 86.8 7.9 64.0 8.5 29.4 7.4 84.0 8.0 58.4 8.6 24.8 7.5 80.6 8.1 52.4 8.7 20.6 7.6 77.0 8.2 45.8 8.8 17.0 7.7 73.2 8.3 39.8 8.9 14.0 0.5M EDTA的配制： 在700ML双蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH调PH8.0（1000ML 0．5M EDTA需加入20克NaOH），补加双蒸水至1升。 TLE缓冲液平衡酚 TLE溶液: 0.2mol/L?Tris 0.1mol/L LiCL 5mmol/L EDTA 用HCL调PH至8.2，用等体积的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次 氯仿：异戍醇（24：1） 8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC处理，焦碳酸二乙酯） 3MOL/L乙酸钠（DEPC处理），将408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸调PH5.2，补加水至1升95%乙醇DEPC处理水 试验步骤： 1、 用液氮冷却研钵，取15g低温冷冻的植物组织，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有150ML研磨缓冲液和50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml离心管中。 2、 加入50ml氯仿：异戍醇，于50℃加热20 min 。18000g, 4℃，离心20 min。 3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml，混匀，再加入50ml氯仿：异戍醇，18000g, 4℃，离心20 min。 4、用 TLE缓冲液平衡酚抽提水相，直至两面相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。 5、 吸取上清液，加1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，4℃沉淀过夜，然后15000g，4℃， 离心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液冲洗。 6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，于 4℃深沉RNA两小时以上。 7、 15000g，4℃， 离心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液冲洗，重溶于2ml双蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸钠溶液和5.5ml无水乙醇，-20℃沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。 8、18000g, 4℃，离心15min，沉淀用1ml双蒸水溶解，取10 ul稀释至1ml测OD260和OD280 Trizol试剂盒方法 原 理 本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。 实验步骤 1．取50毫克植物细嫩组织，加入1ml T