CCK-8操作说明和检测步骤.docxVIP

···· ···· WORD 完美格式编辑 DOJINDO操作说明 细胞活性检测 1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml / 孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 ( 在 37 ℃， 5% CO2的条件下 ) 。 2. 向每孔加入 10 ml 的 CCK- 8 溶液 ( 注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值 的读数) 。 3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 5. 如果暂时不测定 O.D 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl 溶 液或者 1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会 发生变化。 细胞增殖 - 毒性检测 1. 在96 孔板中配制 100 ml 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在 37℃， 5% CO2的条件下 ) 。 向培养板加入 10 ml 不同浓度的待测物质。 3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 ( 例如 : 6,12, 24 或48小时 ) 。 4. 向每孔加入 10 ml CCK-8 溶液 ( 注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值的读 ) 。 5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。 7. 如果暂时不测定 O.D 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl 溶 液或者 1%w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会 发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药 物的影响。 当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基， 直接扣除培养基中加入药物后的 空白吸收即可。 制作标准曲线 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2. 按比例 ( 例如： 1/2 比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。 3. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁， 然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D 值， 制作出一条以细胞数量为横坐标 (X 轴 ) ， O.D 值为纵坐标 (Y 轴 ) 的标准曲线。根据 此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 ( 使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要 一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间 ) 。 专业资料整理 WORD 完美格式编辑 DOJINDO检测步骤 CCK-8 检测步骤 向各孔中加入 100 μl 细胞悬液。 a) 在 37℃下预孵育培养板。 b) 向各孔中加入各浓度的待测溶液 c)10 μ l 。 37 ℃下孵育。 向各孔中加入 10 μ l 的 CCK-8溶液 d) 。 37 ℃下孵育 1-4 小时。 e) 测定 450 nm 处的 OD值。 使用适当的培养基制备 50,000-100,000 个 /ml 的细胞悬液。 建议使用 CO2培养箱过夜预培养。 使用培养基或 PBS来制备溶液。 d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有 CCK-8的待测溶液在 450 nm 处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入 CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基， 并用培养基洗涤细胞两次 ，然后加入新的 100 μl 培养基和 10 μl CCK-8 进行检测。 白细胞可能需要培养较长时间。 活力计算 细胞活力 * （％） =[A( 加药 )-A （空白） ]/[A （ 0 加药） -A （空白） ] × 100 A（加药）：具有细胞、 CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和 CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0 加药）：具有细胞、 CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 问答： 一个孔中应接种多少个细胞？ 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个 / 孔 (100 μl 培养基 ) 。检 测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个 / 孔 (100 μl 培养基 ) 。 如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积 10%加入 CCK-8 溶液。 能否用 384 孔板进行试验？ 可以。向各孔中加入培养基体积 10%的 CCK-8溶液，如果加入的 CCK-8体积太少，可以先将 CCK-8溶液稀释 1 倍，然后加入培养基体积 20%的量。 专业资料整理