第三章基因工程常用技术-918.ppt

第三章 基因工程常用技术 （一）碱裂解法提取质粒DNA 2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤 2）变性 3、影响质粒DNA产量的因素 1）受体菌株 常用质粒的理论产量 （二）DNA的定量和纯度测定 纯DNA样品：OD260/OD280 =1.8 OD260/OD230 2.0 （三）DNA分子量的估计 二、核酸凝胶电泳技术 （二）琼脂糖凝胶电泳 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、核酸分子杂交技术 固相核酸分子杂交 1、Southern印迹杂交 2、Northern印迹杂交 DNA样品 4、夹心杂交(sanwich hybridization) 5、菌落杂交(colony hybridization) 1、模板: 4、dNTPs 双脱氧链末端终止法 3730全自动测序仪 6、原位杂交(in situ hybridization, ISH) 是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。 优点： 不需提取核酸，可完整保持组织或细胞的形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。 FISH检测HER-2基因在 乳腺癌组织中的表达 FISH检测慢性粒细胞白血病的 费城染色体(22和9号染色体异位) 是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 四、聚合酶链反应技术 （polymerase chain reaction, PCR） （一）PCR反应系统的组成 无论哪种DNA，都要有较高的纯度。 质粒 ?-DNA 染色体DNA 大小 较小 较大 非常大 目的基因单拷贝 变性 易 较难 难 用量 l ng 300-500 ng 可以是DNA或RNA。 mRNA cDNA PCR，称为RT-PCR。 逆转录 RNA作为模板时，需要： RT-PCR：Reverse Transcription PCR 是根据模板DNA待扩增区两端的序列而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15-30bp，最多不超过50bp 。 3、引物 2、Taq DNA聚合酶 引物设计的原则： 长度适宜，一般15-30bp； G+C含量40-60％； 4种碱基应随机分布； 内部不应存在互补序列； 两条引物之间不应有多于4个碱基的互补； 3’端不应有任何修饰； 5’端可修饰，如32P、生物素、荧光素。 上游引物5’端： 起始密码子ATG； 注意： 下游引物5’端： 终止密码子TAA、TAG或TGA； 上、下游引物5’端： 限制酶识别序列及其保护碱基。 5’ GGAATTCCCTATGACCCAG 3’ 不同限制酶需保护碱基的数量不同，如： EcoR I 1 Hind III 3 BamH I 2-3 Pst I 4 保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。 保护碱基 终浓度：50?mol/L，4种dNTPs浓度应相等。 注意：不稳定，保存时间长会失效. 1）不同的酶需不同Mg2+： 5、Mg2+： Taq酶：0.5-1.5 mM； pfu酶：2-3 mM； dNTP、引物用量约增加1倍。 EDTA鳌合Mg2+； 选择低浓度TE(10mM Tris, 1mM EDTA)； 如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！ 2）外界影响： DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2+。 1、标记物的种类： 前者更敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。 非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。 放射性：32P、35S、125I等； （二）核酸探针的标记 缺刻平移法 随机引物延伸法 反转录标记法 末端标记法 2、探针标记方法： 1）放射性同位素标记： 5’ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’