质粒DNA的提取定量PCR鉴定课件.ppt

质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定;一、实验流程;二、实验目的;聚合酶链式反应(PCR) Polymerase Chain Reaction;仪器: PCR仪(BioRad MJ mini) 台式离心机 灭菌的薄壁离心管 微量加样枪 凝胶电泳系统等 凝胶成像系统;;1、 菌液：DNA模板 大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T);2、引物： 正向引物： 5’ GTA　AAA　CGA　CGG　CCA　GT 3’ 反向引物: 5’ CAG　GAA　ACA　GCT　ATG　AC3’ 3、2×Premix ： Taq酶：5U/μl 4×dNTP: 10mM each 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3) MgCl2: 25mM 4、灭菌去离子水;① 94℃预变性2 分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 55℃ 30 秒 30 循环 72℃ 60 秒 ③ 72℃ 8 分钟； ④ 4 ℃ 保温。 实验过程约1小时30分钟;温度（℃）;灭菌去离子水;四、结果分析;* 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。;;;PCR 反应系统的组成;(一)模板DNA PCR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体外扩增。 模板的浓度要适当 基因组DNA：50-100 ng 　　　质粒DNA: 5-10 ng;(二)引物 与摸板DNA链互补的小片段DNA分子；作为DNA复制的起始点， 即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。 PCR特异性反应的关键；;引物的特异性：引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成 一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 ～ 1μmol/L 为宜 引物的设计：使用引物设计软件Oligo 6, Primer premier, NTI 9.0, Omiga, Dnastar等;引物的设计原则：;（三）Taq 酶 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的热稳定性 DNA 聚合酶 酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增 每 100μl 反应液中含 1-2.5U Taq DNA 聚合酶为佳 保存：-20 ℃;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);（四）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。;（五） Mg2+;①变性温度与时间;PCR循环次数 循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。;PCR相关技术;荧光定量PCR（real-time PCR）;PCR相关技术;PCR技术的主要用途;PCR的临床应用;质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA;一、什么是质粒？;质粒提取方法;基本步骤;二、实验原理;三、实验材料;米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5，其编码基因位于1号染色体的特异部分（1p36）。当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。根据CHD5的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前，这个基因一直是个谜。这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响，提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失，说明CHD5与人类癌症有莫大关系，打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。 ;溶液P1（细菌悬浮液） 已加入RNaseA 溶液P2（细菌裂解液） 溶液P3（中和液） 去蛋白液PE 洗脱液WB