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高效表达重组毕赤酵母的蛋白质组学研究 内容概要 蛋白质组学技术介绍 毕赤酵母蛋白质组学研究进展 内容概要 蛋白质组学技术介绍 毕赤酵母蛋白质组学研究进展 蛋白质组学 基因组学的延伸—潜能与表征； 质谱鉴定、生物信息学； 时间与空间的响应； 生物过程的终产物； 高通量地研究细胞中所表达蛋白的结构与功能； 蛋白质组学技术路线 内容概要 蛋白质组学技术介绍 毕赤酵母蛋白质组学研究进展 2.1 毕赤酵母的基因组 菌株 基因数（个） GS115 5313 DSMZ 70382 5450 CBS 7435 5007 受环境因子影响的比较蛋白质组学（温度、渗透压）； 甲醇诱导前后的比较蛋白质组学（GS115、X-33）； 不同外源表达压力的比较蛋白质组学； 胞内结构的蛋白质组学（lipid droplets、microsomes、secretome）； 2.2 毕赤酵母的蛋白质组学研究概况 2.2.1 温度对毕赤酵母表达系统的影响 在毕赤酵母中分泌表达抗体 3H6 Fab 时，将温度从 30°C 降低到20°C 培养。 氧化压力响应降低、分子伴侣下调，进入 TCA 循环的代谢流减少等。 蛋白的表达量提高了 3 倍，同时在这两个温度中蛋白酶活力并没有发生很大的变化。 低温培养条件下，蛋白稳定性高，折叠压力低，毕赤酵母细胞能更高效地进行外源蛋白的分泌 2.2.2 渗透压对毕赤酵母表达系统的影响 2.2.3 GS 115——经甲醇诱导高表达HBsAg的响应 6 g/L,114 hrs 碳代谢通路 甲醇异化代谢相关蛋白上调表达； 甲醇同化代谢相关蛋白下调表达。 氧化压力、UPR及ERAD相关蛋白上调表达 There is no significant decrease in the concentration of HBsAg even after prolonged cultivation suggesting that the HBsAg deposits in the ER are well protected from proteolytic degradation. 2.2.4 X-33——经甲醇诱导高表达胰岛素前体的响应 2 g/L, 48 hrs UPR及ERAD相关蛋白下调表达 UPR 通过相关感受器发出一系列的调节信号用: 提高内质网的折叠能力; 加快错误折叠或未折叠蛋白的降解; 限制 mRNA 翻译速度; 以减轻客户蛋白负荷。 ERAD 降解途径: 那些脱离了UPR 和钙联结蛋白周期的未折叠蛋白才能进入 ERAD 降解途径，因此这两个机制限制了未折叠或错误折叠蛋白进入 ERAD 的速率，影响蛋白的降解。 甲醇浓度对UPR相关蛋白的影响 甲醇诱导后，UPR和ERAD通路上调响应不明显，这与胰岛素前体的高稳定性相关。 甲醇诱导前，UPR相关蛋白的高表达说明毕赤酵母具有优越的分泌特性。 2.2.5 GS 115——不同外源蛋白表达压力下的蛋白质组学响应 菌株 G0 GS115菌株含空载质粒pHKa G1 GS115菌株含单拷贝xyn10 G4 GS115菌株含四拷贝xyn10 G4-H GS115菌株含s四拷贝xyn10和共表达HAC1基因 生长曲线及外源蛋白的表达情况 差异蛋白代谢通路总览 G1/G0 G4/G1 G4-H/G4 不同的表达压力下，毕赤酵母会启动一系列复杂的程序响应，并且迅速地改变细胞内全局的蛋白调控和代谢调控来适应不同的外源蛋白表达压力。 UPR机制相关蛋白的响应 低表达（G1/G0）：外源蛋白表达量没有对ER的蛋白折叠形成压力。 高表达（G4/G1）：UPR机制被激活。 过表达HAC1 （G4-H/G4）：UPR机制被显著激活； 同时蛋白合成减弱，生长减慢。 低温 强甲醇异化作用 高蛋白折叠和转运压力 高稳定性的外源蛋白 An efficient microbial cell factory？ 总结 * * * * * * * * * * * *