CR技术及其应用.ppt

PCR产物SSCP多态性检测的具体操作过程 A. 丙烯酰胺凝胶的制作： 1）用温热含去污剂的水清洗玻璃板，充分漂洗(先用自来水，再用去离子水)，晾干。 2）配对玻璃板用夹子固定在板架上，底部用2%琼脂糖封底。 3）根据目的片段的大小配胶(分子克隆419 P)，用磁力搅拌器充分混合各组份后，进行灌胶。倒胶时要避免小气泡的产生。 4）插入梳子，室温下聚合30-60 min。 5）回收封底琼脂糖胶，不要将凝胶板间的琼脂糖胶活动，将凝胶板夹在电泳槽上。 6）拔梳子，加入1×TBE缓冲液。 B. 样品的电泳及固定、染色、显影和终止 1） 取3 μL 特异性好的PCR产物加7 μL SSCP上样缓冲液混合，98℃变性10 min，立即冰浴10 min，用非变性聚丙烯酰胺凝胶(高板)进行电泳检测。电泳条件为300 V预电泳5 min，使样品快速入胶，然后室温恒压150 V电泳12-16 h。 2）固定：从玻璃板上小心取下凝胶，用蒸馏水洗3次，加入固定液固定15 min。 3）染色：回收固定液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过1 min，然后放入染色液中染色20 min。 4）显影：回收染色液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过30 s，放入显影液中显影，待凝胶上看到目的条带，停止显影。 5）终止：将显影后的凝胶放入上述固定液中终止显色反应5-10 min。对胶进行拍照，统计各基因型的个体数。 该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～3O％的变异，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺 1Kb～700bp 3.5 (%) 700b～500b 5 (%) 500b～200b 8 (%) 200b 12(%) 在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾). DRB1-SSCP结果： DD EE GG DD DD HH FG LL DD DD MM FF II 多浪羊DRB1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of DRB1 exon 2 in Dolang sheep DQB1-SSCP结果： BD KK LL II II JJ NN MM CC BB DD CC NN HN AA AA FI BD AF EE KK II LL GG NN MM OO PP JJ LL NN OO KK JJ NN 多浪羊DQB1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of DQB1 exon 2 in Dolang sheep 选取部分基因型个体进行克隆测序,将测序结果与GenBank(FN393736.1)中MHC-DRB1第2外显子的核苷酸序列进行比对。结果见下图： FN393736.1 CACATTTCTTGGAGTATACTAAGAAAGAGTGTCGTTTCTC 40 带型CC ---------------------------------a-----t 40 带型KK -----------------t---c--gc-------------- 40 带型F