新编生物工艺学第二章菌种选育.ppt

2.2.6 DNA重组技术 ④最好在抗性基因或其他标记基因上有一个多克隆位点，以便利用插入失活的功能筛选重组子 ⑤在宿主中能以多拷贝形式存在 ⑥有利于被插入的外源基因表达，最好含有一个强启动子 ⑦能在宿主中稳定地遗传 2.2.6 DNA重组技术 常见的质粒见表２-8 ，表2-9 2.2.6 DNA重组技术 表2-9 2.2.6 DNA重组技术 接上图 2.2.6 DNA重组技术 （2）噬菌体载体 大肠杆菌中常用的噬菌体载体有λ噬菌体，M13噬菌体，fd噬菌体等 λ噬菌体由于对大多数常用的限制酶有较多的酶切位点，故本身不适合作为克隆的载体，但经过改造后可成为克隆载体 2.2.6 DNA重组技术 （3）其他载体　随着基因工程研究工作的深入，人们不断设计出各种特殊需要的载体 ａ．穿梭质粒 它们能在两种不同宿主中存活或表现某些遗传学特征的接合质粒 ｂ．柯斯质粒 柯斯质粒也称为黏性质粒，是指把噬菌体所具有的COS位点组入大肠杆菌素Ｅ1质粒中所形 成的杂种质粒 2.2.6 DNA重组技术 2.2.6.1.3 基因与载体的连接技术 主要有两种方式：黏性末端黏接与钝端的拼接 （1）黏端连接 这是最常用的连接方法 （2）平头连接 （3）加接头 接头是使两种DNA片段连接起来时所使用的核苷酸链 2.2.6 DNA重组技术 2.2.6.1.4 转化 所谓转化是指细胞在一定生理状态时可摄取外源遗传物质，并经体内重组，成为其染色体的一部分，导致受体细胞某些遗传性状发生改变 目前实现转化的主要方法如下 （1）感受态细胞的转化 在基因工程中用得最多 （2）原生质体转化将细菌的细胞经溶菌酶处理 2.2.6 DNA重组技术 （3）碱土金属离子处理 另外还发展了电振荡法、渗压法以及假噬菌体的感染等 2.2.6.1.5 重组体的筛选与表达产物的鉴定 （1）重组体的筛选 ａ．抗药性变化的检测 ｂ．噬斑的形成 ｃ．功能互补 ｄ ．单菌落快速电泳 2.2.6 DNA重组技术 ｅ．原位杂交或区带杂交 ｆ．限制性内切酶图谱 （2）表达产物鉴定 ａ．DNA序列测定 ｂ．产物鉴定 ｃ．功能互补 2.2.6 DNA重组技术 2.2.6.2 工程菌的稳定性问题 2.2.6.2.1 工程菌不稳定性的表现 具体表现为下列三种形式： 质粒的丢失；重组质粒发生 Ｄ Ｎ Ａ片段脱落；表达产物不稳定。 2.2.6 DNA重组技术 因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性 （1）组建合适载体 （2）选择适当宿主 （3）施加选择压力 而在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的不稳定 2.2.6 DNA重组技术 2.2.6.2.2 解决工程菌不稳定性的对策 以提高菌体纯度和发酵生产率。 ａ．抗生素添加法 ｂ．抗生素依赖变异法 ｃ．营养缺陷型法 与上述抗生素依赖变异法相类似 （4）控制基因过量表达 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率 2.2.6 DNA重组技术 （5）控制培养条件 培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率三方面尤为重要 （6）在质粒构建时插入一段能改良宿主细胞生长速率的特殊的DNA片段，也能起到稳定质粒的效果 （7）可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用的质粒不应带有可转移因子 2.2.6 DNA重组技术 （8）冗长的DNA对宿主细胞是一种负担，并会增加其在体内进行DNA的重排，所以尽可能将质粒上的不需要的 DNA部分除去。 （9）固定化重组菌以提高基因工程菌的不稳定性 2.2.7 菌种保藏 2.2.7.1 菌种保藏的重要意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。 2.2.7 菌种保藏 2.2.7.2 菌种保藏的原理和方法 2.2.7.2.1 斜面冰箱保藏法 一般保存期为三个月到六个月 2.2.7.2.2 沙土管保藏法 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。 2.2.7.2.3 菌丝速冻法 对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不能用沙土管保藏。 2.2.7 菌种保藏 具体操作如下 ①配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用 ②制备菌悬液，一般菌悬液的浓度为10～ 10 个／ ｍ Ｌ ；③将菌悬液和甘油溶液以等体积 混合均匀后，置 － ２ ０℃保藏。 2.2.7 菌种保藏 2.2.7.2.4 石蜡油封存法 2.2.7.2.5 真空冷冻干燥保藏法 是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 2.2.7 菌种保藏 2.2.7.2.6 液氮超低温保藏法 液氮超低温保藏法是近几