单抗系列培训完整版.PPT

含血清的DMEM * 96孔细胞板 48孔细胞板 24孔细胞板 6孔细胞板 * 存在问题及解决方案 1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？ （1） 设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法；制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂、载体、抗原与载体的连接比例、 反应时间等多方面去考虑，并加以改进；如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，如 KLH 。 * （2） 免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之 间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果。 （3）免疫佐剂不合适。弗氏佐剂也不能保证完全有效，TiterMax 等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，此时可以考虑更换佐剂尝试。 （4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。 （5）免疫途径不合理。 （6） 测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1:500或1:1000开始作梯度稀释。对于多肽和小分子物质，效价达到1:2000甚至更低仍可视为免疫成功。 * （7）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、 采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。 2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？ （1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用 SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用 Balb/C 小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。 （2）培养基中加入了过高浓度的 HAT，或者仅 A 的浓度过高或 HT 的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作 HAT 浓度筛选。 （3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。 （4）未正确制备饲养细胞。 （5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。 * （6） 细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。 （7） 细胞培养条件不正确。确保细胞培养在恒定的37℃较湿的环境，同时保证 CO2浓度在4-5%左右。 （8）其它与融合条件相关的不恰当的因素。 * 3. 为什么融合后得不到阳性克隆？ （1）动物未免疫成功就进行了融合。 （2） 融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。 （3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用 ELISA 作为筛选方法的，成功率也有待商榷。 （4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗 原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。如果需要制备抗 BSA 的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的 BSA 直接与抗体相结合，最后做 ELISA 筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做 ELISA 筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。 （5） 其它所有能影响 ELISA 等相关筛选手段的因素。 * 4 . 为什么细胞生长很慢？ （1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT 或 HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。 （2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。 （3）制备饲养细胞的方法不正确。 * 5. 克隆原来检测是阳性的，为什么后来转为阴性了？ 首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。 但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性，一般可以从这几个方面加以注意： （1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了。除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。 （2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。 （3）