第十章 传染与免疫 第四节 免疫学方法及其应用.pptVIP

微生物学 浙江工业大学生物技术系 裘娟萍 钟卫鸿 邱乐泉 汪琨 第四节 免疫学方法及其应用 免疫酶技术的优点： ①由于是产色反应，故可用普通光学显微镜观察结果； ②标本经酶标记的抗体染色后，还可用其他染料复染，以显示细胞的形态构造； ③标本可长久保存，随时查看； ④特异性强； ⑤灵敏度高。 标记酶应具备： ①纯度高、特异性强、稳定性和溶解度好； ②测定方法应简单、敏感、快速； ③与底物作用后会呈现颜色； ④与抗体交联后仍保持酶的活性。 最常用的是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），它是一种糖蛋白，主要成分是酶蛋白和铁卟啉，相对分子量为4.0×104，底物是二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）。DAB经水解后可产生棕褐色沉淀物，可用目测或用比色法测定。 此外，还有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）、脲酶（urease）和β-D-半乳糖苷酶（ β-D-galactosidase）等。 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA），又称酶标法，已被广泛用于各种抗原和抗体的检测中。 双抗体夹心法（double antibody sandwich method，sandwich ELISA） 间接免疫吸附测定法（indirect immunosorbant assay， indirect ELISA ） 常用 双抗体法是一种测定待检标本中是否含抗原的方法，其主要步骤为： ①将含已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次； ②加入待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，将多余的抗原洗去； ③加入对待测抗原有特异性的酶联抗体，使形成“夹心”； ④加入该酶的底物，然后产生可见的有色酶解产物（黑圆点），这就说明在孔壁上有与已知抗体特异的抗原存在。 ??????????????????????????????????????????? 可用于组织切片、细胞培养标本等组织或细胞抗原的定性、定位，也可用于可溶性抗原或抗体的测定。 四、生物制品及其应用 在人工免疫中，可用于预防、治疗和诊断用的来自生物的各种制剂，都称生物制品（biologics，biologic products）。 生物制品 特异性的抗原（疫苗、菌苗、类毒素） 抗体（治疗用的血清、诊断用的血清、免疫球蛋白、单克隆抗体等） 细胞免疫制剂 非特异性的免疫调节剂 （immunoregulative preparation） 人工自动免疫类生物制品 人工被动免疫类生物制品 （一）疫苗（vaccine） 菌苗 疫苗 用于预防传染病的抗原制剂称为疫苗。 用病毒、立克次氏体或螺旋体等微生物制成的生物制品 用细菌制成的生物制品 * * 传统的免疫学方法仅局限于用体液免疫产生的抗体与各种抗原在体外进行反应，所用抗体都取自血清，因此称作血清学反应（serologicalreaction）。 体液免疫 细胞免疫 现代免疫学方法 免疫诊断学（immunodiagnostics） 免疫学检测，等分支技术学科 一、血清学反应 1. 定义 在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应。 已知抗体 已知抗原 未知抗体 未知抗原 检测 检测 2. 血清学反应的特点 （1）特异性 抗原决定簇和抗体分子V区间的各种分子引力是它们间特异性的物质基础。 A抗原 结合 A抗体 B抗原 B抗体 结合 A抗原 刺激机体 A抗体 B抗原 B抗体 （2）可逆性 抗原抗体间的结合仅是一种物理结合，故在一定条件下是可逆的。 抗原与抗体结合后，其原有的毒性等性状均为改变。 抗原物质表面的抗原决定簇数目一般较多，多价； 抗体一般仅以Ig单体形式存在，双价。 （3）定比性 抗原与抗体结合，只有两者分子比例适当才能形成肉眼可见的反应。 抗原与抗体的反应一般有两个明显的阶段。 时间长 时间短 可见 复合物与环境因素作用 （从数分钟至数小时或数天） 第二阶段 不可见 抗原与抗体结合形成复合物 （一般仅数秒） 第一阶段 （4）阶段性 最佳条件一般为： pH=6～8， 37～45℃， 适当振荡， 以及用生理盐水作电解质等。 （5）条件依赖性 二、抗原、抗体间的主要反应（一）凝集反应（agglutination） 颗粒性抗原（完整的细菌细胞或红细胞等）与相应的抗体在合适的条件下反应并出现肉眼可见的凝集团的现象，称为凝集反应（agglutination，agg，aggl）或直接凝集反应（direct agglutination）。 在作凝集反应时，由于抗原体积巨大，抗原结合价相对较少，所以为使抗原和抗体间