沉降系数和密度梯度离心.docVIP

沉降系数和密度梯度离心 对于一个质量为m的颗粒（蛋白质或核酸等其他生物分子），当放在离心力场中，例如角转头中，受到一个离心力作用fc： fc＝m（1－vρ）ω2r 其中r为处于离心管中的颗粒到转头中心的距离。ω为角速度（弧度/s）（ω＝（2π/60）×RPM），RPM为转头每分钟的转数。（1－vρ）为浮力因子，ρ为溶液密度，而v为偏微比容（mL/g），定义为一克干物质置于无限大体积的溶剂中时溶液体积的增量。一般认为v等同于1/ρp，ρp是颗粒的有效密度。如果ρp等于ρ，则没有净的力作用于颗粒上，这样的颗粒将不会沉降。颗粒的运动受到阻力（fr＝fv）的影响，v是运动速度，而f为摩擦系数。当沉降速度达到稳定状态时，fr＝fc， fv＝m（1－vρ）ω2r 变换一下方程，用场强去除速度，得到： S＝v/ω2r=m（1－vρ）/ f＝M（1－vρ）/ fN 其中M为分子量，N为阿伏伽德罗数，即M＝mN。S称为沉降系数，其单位为秒。典型的S值一般在10－13s，所以该数值命名为1 Svedberg单位，简写为S，纪念离心机研究先锋Theodor Svedberg。例如，核糖体的沉降系数为70×10－13，或简写为70S。很清楚，S值随着颗粒质量的增加而增加，但其关系不是线性关系，因为，摩擦系数与颗粒质量大小和形状都有关系。用S可以近似表示分子量。 处于离心场中的固定角转头中颗粒的受力情况 由于不同大小的颗粒或分子的S不同，所以可以利用离心沉降技术将它们分开。如果是只是简单地将大的颗粒和沉淀物从分子溶液中除去，只需使用角转头低速离心就可实现。如果要将几类大分子通过离心分开，就要用蔗糖梯度离心技术。首先在离心管中制作一个蔗糖溶液的梯度，然后将样品加到梯度溶液的上面，经离心，样品中的几个成分按照它们的密度被分开。最后在离心管底部穿个孔，分部收集。 密度梯度离心 22、滚环复制 这种复制机制主要存在于噬菌体（如φX174）中，噬菌体复制时其单链的基因组（＋链）在引发酶和DNA pol III作用下合成互补链（－链）转换成双链环状分子，称为复制型DNA。然后复制型DNA又作为滚环复制（rolling-circle replication）的模板，生成新的单链DNA分子（图17.12）。通过这一机制合成的单链DNA被整合进新的噬菌体颗粒内。φX174的DNA复制就是滚环式复制。 首先一个引发体组装在模板链（＋）链上 ，开始合成RNA引物，然后在DNA pol III作用下，引物延伸生成一个互补链（－）链，生成的双链DNA分子通过一个噬菌体编码的内切酶在（＋）链上的特定部位制造一个缺口。最后在DNA pol III作用下，（＋）链从暴露出的3ˊ羟基延伸，取代原来的（＋）链，使（＋）链游离出来，相当于生成一个（＋）链的拷贝。 23、D-环复制 线粒体DNA的复制采取的是一种特殊的D-环（取代环）复制方式。环状双螺旋DNA在某一点解旋，开始复制。但前导链和滞后链的起点不在同一位点。首先合成前导链，结果一条链（滞后链模板）仍维持单链。形成一个D字型的环。当前导链合成到某一点时，露出滞后链的起点，滞后链开始复制。