细菌内毒素检查法讲稿.pptVIP

细菌内毒素检查法2008年12月 郑州 中国药品生物制品检定所 蔡 彤 一、背景介绍 热原 细菌内毒素 细菌内毒素检查法反应机理 热原 热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 细胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原  非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素） 细菌内毒素 细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一 化学结构 含有3个不同的区域 ? O-特异侧链? 核心多糖? 类脂A 细菌内毒素 致热性 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原 性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢， 引起发热反应 耐热性 分子极性 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性 在水中呈不均匀分布 酸碱性与 强酸强碱水解反应 鲎反应性 细菌内毒素检查法反应机理 细菌内毒素检查法反应机理 在药品生产质量管理规范（GMP）条件下进行药品生产的质量控制，一般可以接受的观点是，不存在内毒素就意味着不存在热原 通过检测内毒素控制药品中的热原 二、细菌内毒素检查法介绍 细菌内毒素检查法定义： 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素检查 凝 胶 法 细菌内毒素检查----------凝胶法 1、综述部分 实验原理 实验准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD） 37± 1℃下保温反应60?2分钟 当样品中细菌内毒素的浓度达到或超过鲎试剂的灵敏度时，凝集为坚实凝胶，为阳性，记为“+”。 当样品中细菌内毒素的浓度未达到鲎试剂的灵敏度时，不能凝集为坚实凝胶，为阴性，记为“—”。 2、凝胶法实验的准备 实验所需物品 细菌内毒素标准物质 细菌内毒素检查用水 凝胶法鲎试剂 漩涡混合器 适宜的恒温器 37± 1℃ 电热干燥箱 250 ℃ 实验器械等 2、凝胶法实验的准备 细菌内毒素标准物质 国家标准品 以内毒素国际标准品为基准标定效价 150600-200707 10000EU/支 工作标准品 以内毒素国家标准品为基准标定效价 150601-200862 120EU/支 2、凝胶法实验的准备 细菌内毒素检查用水 用于复溶内毒素标准品、稀释内毒素及样品、溶解鲎试剂等 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。 2、凝胶法实验的准备 凝胶法鲎试剂 8个鲎试剂厂家 灵敏度0.5~0.03EU/ml 规格0.5ml、0.1ml等 2、凝胶法实验的准备 漩涡混合器 2、凝胶法实验的准备 适宜的恒温器 恒温水浴 恒温培养箱 干热恒温器 试验器械的要求 移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。 试验器械的要求 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 试验操作过程应防止微生物的污染。 2、凝胶法实验的准备 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸