GB/T 22916-2008水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 22916—2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 Protocol of fluorogenic RT-PCR for vesicular stomatitis virus 2008-12-31 发布 2009-05-01 实施 发布 GB/T 22916—2008 -1.Z- —1— 刖 弓 本标准参考了世界动物卫生组织 （（）IE） 《陆生动物诊断试验和疫苗手册 （哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 （第5版）。 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位 ：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 、中华人民共和国云南出入境检验检 疫局c 本标准主要起草人：花群义、周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁。 T GB/T 22916—2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2. 1 荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4 DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水 （配方见附录A）o 2. 6 Taq 酶 Tag DNA聚合酶。 2.7 VSV 水泡性口炎病毒。 3原理 水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列 ，合成一对特异性引 物和一条特异性的荧光双标记探针 。通过严格设计和筛选的引物和探针 ，涵盖水泡性口炎病毒的两个 型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针 。探针的5 ’端标记FAM荧光素，它发出的荧 光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团；3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5 ’端报告 荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团 。在扩增时 ,Taq酶发挥它的5~3 ‘端外切核酸酶的功 能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液 中，仪器检测到发出的荧光信号。 4材料与试剂 4.1仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪。 4. 1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min以上）。 4. 1.3台式离心机（离心速度3 000 r/min） 0 4. 1.4混匀器。 4. 1.5 冰箱 （2 °C〜8 °C和一2（TC两种）。 4. 1.6微量可调移液器 （5 mL,10 mL,100 mL,1 000 ML ）及配套带滤芯吸头。 1 GB/T 22916—2008 4. 1.7 Eppendorf 管 （1. 5 mL）、透明薄壁 PCR 管 （0. 2 mL）。 4.2试剂 4.2.1除特别说明以外，本标准所用试