qPCR的原理.docVIP

原理 （1） PCR： Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需 要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。 PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是 循环数)。实际中，扩增效率不为100％。 Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普 通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩 增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。 一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线 （amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以 考虑。 普通PCR 是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。对于判 断目的DNA 有没有，是出色的。但对于检测目的DNA 有多少分子（初始的时 候），则勉为其难。因为PCR 的理想和实际仍相差一段距离。理论界普遍认为， PCR 的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR 的因素，如dNTPs 分解产生焦磷酸）的量少，PCR 可以是理想的——即每个循环后扩增子 增加一倍。然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相 对较高，PCR 的效率就会降低，直至为0。所以实际的扩增曲线是“S”型的， 而不是“J”型。 图2：扩增曲线。 理想：J 型，2N 方程。 实际：S 型。分为：不可检测期，指数期，平台期。 这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的：配好若干（如40）相同的 PCR 体系，分别进行1，2，3……40 个循环，再用测OD 等定量方法来知道有多 少扩增子产生，作图。 由于对极少量DNA(1~数千？)的直接定量办法还没有，该扩增曲线的最初 若干循环，扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开。 Real time PCR 同样不能直接测出初始DNA 的分子数，不过，它采用的数据 是在PCR 中期，比末期定量要准确。（更接近理想情况。） （2）Real time PCR 的化学基础 real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质， 使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线 （如，图2，3）。 图3：real time PCR 的扩增曲线。 名词解释： ?Rn:一个反应管经n 次热循环后，测得的荧光强度。(Normalized with ROX-参比染料。) ?Rn+:反应管含有模板DNA。 ?Rn-:反应管不含有模板DNA。 ?无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数 值。 ?Threshold: 荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。 ?Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循 环数。 ?基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直 到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。 ）