一种改进基于PCR建立饱和突变库方法.PDFVIP

第４１卷第１期 湖北大学学报(自然科学版) Ｖｏｌ.４１　 Ｎｏ.１　 ２０１９年１月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ) Ｊａｎ. ꎬ２０１９　 文章编号:１０００ ２３７５(２０１９)０１ ０００１ ０４ 一种改进的基于ＰＣＲ 的建立饱和突变库的方法 佘文文ꎬ倪静ꎬ马立新 (湖北大学生命科学院ꎬ湖北 武汉４３００６２) 摘要:定点饱和诱变技术一直以来被广泛应用于蛋白的定向进化和代谢途径的研究ꎬ然而建立偏爱性低的高质量饱 和突变库一直面临着严峻挑战. 提出一种改进的建立智能突变体文库的方法ꎬ选取柠檬烯环氧水解酶(ＬＥＨ)为突变对 象ꎬ摒弃传统的ＮＮＫ/ ＮＮＮ密码子简并引物ꎬ采用半理性设计突变氨基酸的方法ꎬ将ＰＣＲ反扩载体与Ｔ５介导的克隆方 法联用ꎬ构建一个随机的四点组合突变体库ꎬ突变效率高达８１.２５％. 此外ꎬ突变库的偏爱性大大降低ꎬ突变氨基酸的分 布趋于平均ꎬ表现出低测序倍数基础上的高覆盖率. 因此该方法极大提高了突变库的质量ꎬ降低了筛选成本ꎬ为蛋白质 工程和生物合成的研究提供了好的思路. 关键词:定点突变ꎻ饱和突变ꎻＰＣＲꎻＴ５核酸外切酶ꎻ偏爱性 中图分类号:Ｑ８１９　 　 文献标志码:Ａ　 　 ＤＯＩ:１０.３９６９/ ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣２３７５.２０１９.０１.００１ Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ＳＨＥ ＷｅｎｗｅｎꎬＮＩ ＪｉｎｇꎬＭＡ Ｌｉｘｉｎ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｕｂｅｉ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ４３００６２ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ (ＳＭ) ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｓꎬ ｃｒｅａｔｉｎｇ ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｂｉａｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒꎬｗｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｌｉｂｒａｒｙꎬｌｉｍｏｎｅｎｅ ｅｐｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ (ＬＥＨ)ｗａｓｃｈｏｓｅｎｔｏｂｅｍｕｔａｔｅｄꎬｉｎｓｔｅａｄｏｆ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＮＮＫ/ ＮＮＮｃｏｄｏｎｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ａｓ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓꎬｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｈｏｓｅｎ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｌｐｈａｂｅｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔ５ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅꎬａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｎ ｆｏｕｒ ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＬＥＨ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬ８１.２５％ ｏｆ ｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＤＮＡ ｍｕｔａｎｔｓａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄꎬｗｈｉｃｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ １０％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ. Ｂｅｓｉｄｅｓꎬｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｔ ｅａｃｈ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｂａｌａｎｃｅｄꎬｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｌｏｗ ｂｉａｓ ａｎｄ ａ ｈｉｇｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｌｄ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉ