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PCR技术检测食品有害微生物的应用 Applications of PCR in the field of foodborne pathogens 叶云 容元平 YE Yun RONG Yuan-ping （广西工学院生物与化学工程系，广西 柳州 545006） (Department of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Technology, Liuzhou，Guangxi 545006, China) 摘要：介绍了PCR技术的原理及其在食品有害微生物检测中的应用，同时提出了 尚存在的问题，并对其应用前景作了展望。 关键词：PCR检测；有害微生物；食品安全 Abstract：The principle and applications in food of PCR are introduced inthispaper.Thepresentproblemsandthefuturetrendsofthisresearch direction are also discussed. Keywords：PCR inspection； Foodborne pathogens；Food safety 现代食品行业，有很多有害的微生物严重危害食品的品质和人们的健康，甚 至会引起一些严重的疾病。而随着经济的迅速发展，对各类食品的需求也日益增 大，因有害微生物引起的各类食物中毒事件也逐渐增多。然而，使用传统的检测 方法即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但费力、耗 时，一般需4～7d才能完成。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致菌体 的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得传统的检测方法受到了一定的限 制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污 染及其可能对人体健康产生的危害。分子生物学技术的发展使得许多食品工作者 得以寻求更为快速有效的方法来检测病原菌，以期增加敏感性和显著地减少检测 时间。其中，PCR技术是比较有效，也是应用得最为广泛的一种检测方法之一。 ———————————— 作者简介：叶云 （1978-），男，广西工学院生物与化学工程系讲师。 E-mail:yeemvan@126.com 收稿日期：2006-11-29 1 原理 PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是1985年美国科学家 Mullis发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，又称为基因的体 外扩增法。原理是首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入两段人工合成的 与靶DNA两端正邻近序列互补的寡核苷酸片断作为引物(Primer)、即左端引物和 右端引物；该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA聚合酶和4种 dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链按5’→3’方向延伸，自动合成新的 DNA双链。新合成的DNA双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的DNA多聚酶链 反应。经过25～35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。 PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测，但由于其精确、微量的特点， 已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深 入，许多致病菌的遗传背景进一步明了，PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其 [1] 应用前景。利用PCR方法对病原菌进行检测早在1992年就有报道 ，然而利用PCR 技术从食品中检测病原微生物直到近几年才得到比较广泛的应用。 2 PCR检测食品有害微生物的主要流程 2.1 引物设计 PCR引物对扩增的特异性起着关键的作用，引物的优劣直接关系到PCR扩增的 特异性和成功与否。设计的准确性则取决于对所检测对象的遗传背景的了解。随 着分子生物学的迅速发展，各种微生物的基因序列的逐渐明了，使得引物设计变 得更为容易。同时，靶序列的选择也是决定PCR结果的关键因素，引物不同则扩 增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低PCR检 测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因此，通常要求引物位于待分析基因组中 的高度保守区域，长度为1