微生物限度检查操作规程.docVIP

微生物限度检查操作规程 1.目的：建立一个测定微生物限度的检查方法。 2.范围：适用于需测定微生物限度的样品。 3.责任：质检科无菌检验员对实施本规程负责。 4.程序 4.1概要 4.1.1微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受到微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 4.1.2微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区与工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 4.1.3供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。 4.1.4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃，控制菌培养温度为35℃～37℃ 4.1.5检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。 4.2检验量 4.2.1检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。 4.2.2除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂为100cm2；贵重药品，微量包装药品的检验量可以酌减。 4.2.3检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 4.2.4一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。 4.3供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 4.3.1液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 4.3.2固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 4.3.3需用特殊供试液制备方法的供试品——具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下： 4.3.3.1培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 4.3.3.2离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。 4.3.3.3薄膜过滤法 见下述细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。 上海长征富民金山制药有限公司 4.3.3.4中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。 4.4细菌、霉菌及酵母菌计数 4.4.1计数方法验证 4.4.1.1当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。 4.4.1.2验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 4.4.2菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种微第0代），并采用适宜的菌种保藏计数，以保证试验菌株的生物学特性。 4.4.2.1大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44 102] 4.4.2.2金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003] 4.4.2.3枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501] 4.4.2.4白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001] 4.4.2.5黑曲霉（Aspergillus n