一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法.pdfVIP

动物营养学报２０１８，３０（５）：１８３７⁃１８４４ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１８．０５．０２６ 一种猪胃肠道内容物与粪便 微生物梯度离心分离方法 李金龙　 王　 瑶　 马娅君　 陈庆菊　 卢昌文　 唐志如∗ （西南大学动物科技学院，生物饲料与分子营养实验室，重庆 ４００７１５） 摘　 要： 本试验旨在探究一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度分离方法。 试验首先用分离 缓冲液对猪胃肠道内容物及粪便样品进行稀释，寻找最佳稀释比例，再进行梯度离心得到胃肠 道内容物及粪便样品中的微生物菌体。 本方法得到胃、空肠和回肠内容物样品与分离缓冲液的 最佳稀释比例范围为８．０％～１２．０％，样品的称取量范围为３．２～４．８ ｇ；盲肠、结肠内容物及粪便 样品与分离缓冲液的最佳稀释比例范围为２．０％～４．０％，样品的称取量范围为０．８～１．６ ｇ。 对饲 喂３种饲粮蛋白质水平（１２．０％、１５．０％和 １８．０％）３０ ｋｇ 的猪胃肠道内容物与粪便微生物进行分 离，并对其回肠内容物和粪便中微生物氨基酸组成以及胃肠道内容物与粪便中微生物多样性进 行检测。 结果显示：回肠内容物和粪便中微生物菌体大部分氨基酸对饲粮不同蛋白质水平的营 － 养模式响应效果显著（Ｐ＜０．０５），胃肠道内容物与粪便样品微生物的聚合酶链反应 变性梯度凝 胶电泳（ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ）条带丰富和清晰。 试验结果表明，该方法分离程度高，获取菌体干重多，同 时还具有成本低廉、操作简单、重复性好等特点，可为更深层次的研究肠道微生物的生理功能提 供方法。 关键词： 猪；胃肠道内容物；粪便；微生物；梯度离心 中图分类号：Ｓ８２８　 　 　 　 文献标识码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１８）０５⁃１８３７⁃０８ 　 　 动物肠道内定植着种类繁多和数量庞大的微 用生物学技术进行分析检测的前提基础，但目前 １３ １４ ［１］ 生物，其数量为 １０ ～１０ 个 ，构成了一个错综 国内外缺乏从胃肠道内容物和粪便中进行微生物 复杂的生态系统。 肠道内的微生物对宿主能量代 分离的统一标准。 因此，本试验旨在摸索猪胃肠 谢、营养物质吸收、机体生理和免疫功能的发挥等 道和粪便微生物与分离缓冲液的适宜比例，采用 － ［２ ３］ 方面起着关键性的作用 。 随着分子生物技术 梯度离心法从猪胃肠道内容物和粪便中对微生物 的蓬勃发展，众多研究肠道微生物的分子生物学 进行分离，以寻求胃肠道内容和粪便中微生物的 技术不断涌现，如指纹图谱技术［聚合酶链反应－ 最佳分离条件，为进一步深入研究肠道微生物氮 变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ）］、荧光原位杂交 营养素的代谢、内源性氮和氨基酸的组成、微生物 ［４］ 技术、实时荧光定量ＰＣＲ等 。 然而，如何高效地 区系以及粪便微生物氮和氨基酸排出情况等研究 从动物胃肠道及粪便中将微生物进行分离，是运 提供方法。 － － 收稿日期：２０１７ １１ ０３ 基金项目：国家自然科学基金；西南大学基本科研业务费（ＸＤＪＫ２０１７Ｄ０３８）；重庆市留学人才创新计划重点项目（ｃｘ２０１７０２４）； 重庆市自然科学基金（ｃｓｔｃ２０１６ｊｃｙｊＡ１４１４）；国家留学基金委西部计划 （２０１５０８５０５１７０）；国家 ９７３ 重点基础研究发展计