原理大肠杆菌染色体呈环状.pdf

中国试剂网 3.17.4.7 3.17.4.7 大肠杆菌杂交及基因定位实验 一、原理 大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株（Hfr ）的染色体上整合有F 因子，当Hfr 细菌与 F －细菌细胞发生接合（即杂交）时 Hfr 细胞（供体菌）的染色体从 Hfr 细胞向 F －细胞内转移。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中 断，因此根据结合后 F －细菌（以重组子形式选出）中Hfr 细菌染色体基因出现 次数的多少，即可得知基因转移的先后顺序，也就是说基因在染色体上排列的顺 序。转移时，靠近转移起始点的染色体基因进入 F －细胞的机率大，重组频率高， 远离转移起始点的基因进入 F －细胞的机会少，重组率低，F 因子大部分位于转 移起始点相对的一端（末端）。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长，足 以使整个染色体转入 F －细胞（受体）时，才会使 F －细胞转变为 Hfr 或 F ＋状 态。 基因定位时首先要从 Hfr 与 F －细菌的混合培养物中筛选出某一 Hfr 与 F －细菌 基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子 中逐个测定其它的 Hfr 基因（非选择标记）出现的次数。Hfr 菌株染色体上的选 择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以 100％的频率出现在重组子中。选 择性标记之后的基因，则以低于 100％的频率出现在重组子中。F －细胞的选择 性标记应起到排除 Hfr 菌生长的作用 （即反选择）。本实验使用的 F －菌株为 Strr, Hfr 菌为 Strs,借此可排除 Hfr 菌的生长。另一方面为保证 Hfr 基因有机会出现在 重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使 Hfr 菌株有较高的接合频率， F －细菌应该过量以保证每一个Hfr 细菌都能与 F －细菌接合（10～20 ：1）。 二、目的 通过本实验，了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式，并掌握大肠杆 菌接合及染色体基因定位的原理与方法。 三、材料、试剂与器具 1、受体菌：FD1004 F －leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT strr rifr 。 3.17.4.7 2 、供体菌：CSH60 Hfr sup strs 。 3、生理盐水：0.85%NaCl 。 4 、10×A 缓中液。 5、基本培养基。 6、LB 培养基。 7、选择培养基[B]—[G]：基本培养基加氨基酸（表 1－2 ）。 8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。 四、操作步骤 1、第一天傍晚，分别接一环供体菌和受体菌于 5ml LB 培养液中，37℃振荡培养 10－12 小时。 2 、第二天清晨，各取 1ml 过夜培养物，分别加入到 2 个盛有 5ml LB 培养液的 250ml 三角瓶，37℃振荡培养2 －3 小时。 3、吸取 0.5ml 供体菌和 4.5ml 受体菌，加入到一个无菌的 250ml 三角瓶中混合， 置 37℃摇床上培养 100 分钟。 4 、将上述接合菌液用生理盐水稀释 100、10-1、10-2 倍。 5、各吸取 0.1ml 稀释液涂布在选择培养基[A]平板上，每一种稀释液涂布 2 个平 板。同时将供体菌及受体菌分别吸取 0.1ml 涂布在[A]上作对照，每种各 2 个平 板。此后均于 37℃条件下培养48 小时。 6、第四天，1）观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状 况；2 ）在与平皿相同大小的白纸上画 100 个小格，将圆片贴于选择培养基[B]、 [C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A] 平板上随机挑选 100 个菌落，对号点种在选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和 [G]平板的 100 个小格中；3 ）将所有平板置于37℃箱内培养48 小时。 7、第六天，统计在各种选择平板上生长菌落的数目，记录。并绘制出基因顺序 图。 选择性培养基附加成份表 培养基 选择性 基本 基本培养基（A ）中补充物质 编号 标记