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含GUS报告基因的转 　　一、原理　　Gus(b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。Gus基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶，可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。　　二、目的　　了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。　　三、材料与试剂　　1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。t　　2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。　　3、50mM磷酸缓冲液(pH)。　　4、染色液：100mMK3[Fe(CN)6],100mMK4[Fe(CN)6]10mMNa2EDTA,%(v/v)tritonX-100,20%甲醇，/mlX-Gluc,磷酸缓冲液(50mM,pH)。　　5、70％乙醇。　　四、操作步骤　　1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37℃恒温条件下保温过夜。　　2、转入70％乙醇中脱色2－3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。　　3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。　　4、83％、95％、100％乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。　　5、常规石蜡切片法切片，番红染色。　　6、显微镜下观察、拍照。　　五、说明　　1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染；B）保温时间过长。　　2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入%NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。　　3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。　　1、对实验结果进行文字描述。　　2、根据你的实习谈谈gus活性检测时应注意哪些问题。　　注意事项：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而　　异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片。当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。　　3、gus基因为什么被称之为报告基因？在转基因应用中有哪些优缺点。　　报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物　　非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。报告基因必须具备的条件：(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定。(4)细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。　　GUS活性检测优点　　在大多数植物组织中GUS活性的本底低；反应产物基本不扩散，在植物细胞内积累；　　通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。　　GUS基因作为报告基因的优势：　　?　　?　　?GUS蛋白在植物细胞中稳定存在，对较高的温度和去污剂有一定的耐受性；检测方法简单，可定性或定量：使用X-Gal为底物，通过显色反应来观察；使用4-MU为底物，多数植物组织中GUS背景表达低，样品表达能够很好区分。反应以后生成荧光物质，通过相应的荧光检测仪来进行经确定量；　　缺点　　不适用于活体组织的观察；　　在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应产物渗漏的现象，但是可以　　通过在底物溶液中加入氧化剂氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加，来使这种渗漏减至最少。　　宁波农业科技1999No.4　　报告基因gUS在快速筛选转抗虫基因水稻中的应用?　　沈岚　　(宁波市农科所)　　摘要利用GUS组织化学染色法和PCR技术，对转抗虫器因水稻与常规品种的杂种后代进行了鉴定和　　分析。研究结果表明，报告基因gu。在杂种后代中的分离行为符合3:1的比率，表现为单荃因显性遗传;凡　　GUS组织化学染色为阳性的植株都携带crylAb基因，二者吻合率为100o，表现完全连锁遗传，证明可以　　采用GUS组织化学染色法来快速筛选含有抗虫基因crylAb的个体。　　关扭词水.稻;报告基因gus;抗虫基因crylAb;连锁遗传;快速筛选　　水稻是最重要的粮食作物之一，在水稻　　生产中，二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等鳞　　翅目害虫发生较为猖撅，每年都会给水稻产　　量造成巨大的损失。培育抗虫品种是防治害　　虫