基因表达的检测.pptx

基因表达水平的检测;一、基因表达的概述： ;二、基因表达调控的基本概念与原理：;2. 基因表达调控的基本原理：;DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：;蛋白质之间相互作用对基因表达的影响： 调节蛋白通常通过二聚体（dimer）或多聚体（polymer）的形式与DNA结合 不同的调节蛋白也可以相互作用或结合后，再与DNA特定部位结合，调节同一基因的不同转录水平，尤其多见于真核生物。 蛋白质之间相互作用的典型特征包括： 亮氨酸拉链（leucine zipper） 螺旋－转角－螺旋（helix-loop-helix）;三、原核生物的基因表达调控：;阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节;2） 其它转录调控机制：;四、真核生物的基因表达调控：;（一）、DNA水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：;基因丢失： 在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。 染色体破碎所致的不均等分配。 仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。 基因扩增： 　　细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是细胞在短期内为满足某种需要（发育需要、外界环境因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。 ;基因重排： 　　基因重排是指某些基因片段改变原来的存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。一种熟知的以基因重排来调节不同基因表达的例子是哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接： 一个免疫球蛋白分子包括两条相同的轻链和重链。 轻链：可变区、恒定区、连接区都由位于同一染色体不同位置的DNA片段编码，在形成活性基因前，上述各一个基因通过染色体内重组成连到一起。 重链：可变区、恒定区、连接区、歧化区;（二）、转录水平的调控： ;转录起始复合物: 转录起始复合物的形成过程有三步： TATA因子结合TATA盒（形成TATA因子－DNA复合物） RNA pol识别并结合TATA因子－DNA复合物（闭合复合物，DNA双链没有打开，不能启动转录） 转录起始因子与RNA pol结合，形成转录起始复合物（开放复合物，DNA双螺旋已打开，可以合成RNA） 转???起始的调控： 基因表达的转录水平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。 反式作用因子的活性调节： 表达调节：迅速合成、迅速降解 共价修饰：磷酸化－去磷酸化、糖基化 配体结合：激素－激素受体（是核内的反式作用因子） 蛋白质与蛋白质相互作用：max蛋白－c-myc蛋白（核内的反式作用因子）;反式作用因子与顺式元件结合的调节： 　顺式作用元件包括： 上游启动子元件 远距离的增强子元件（上游增强子元件、下游增强子元件） 反式作用因子作用方式的调节： 反式作用因子通过下列不同的方式作用到RNA聚合酶结合位点从而影响其转录活性： 成环 扭曲 滑动 连锁反应 反式作用因子的组合式调节： 几种不同的反式作用因子组合，发挥特定的作用。 ;（三）、转录后水平的调控： ;mRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性： 5’加帽（capping）：7－甲基鸟苷三磷酸 3’端加尾（tailing）：多聚A（Poly A）;RNA编辑的调控： RNA编辑（editing）：是指转录后的mRNA前体在编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括： 核苷酸的替换 核苷酸的插入或缺失 mRNA转运的调控： mRNA前体经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核内运至胞浆。 大约只有20%的mRNA进入胞浆，留在核内的mRNA约50%会在1小时内降解。;（四）、翻译水平的调控： ;（五）、翻译后水平的调控：;五、蛋白表达水平的检测方法及选择;Southern Blot; 重物（400克）;Polymerased Chain Reaction (PCR);2. 方法;DNA 序列测定;模板准备： 纯度：推荐使用试剂盒进行纯化 模板量：　PCR产物 100-200bp 2-4ng 单链 50-100ng 　 200-500bp 4-10ng 双链 200-500ng 　 500-1000bp 6-20ng 粘粒、BAC 0.5-1ug 　 1000-2000bp 10-40ng 细菌基因组DNA 2-3ug 　 ? 2000bp 80-2000ng 测序PCR：用于PCR产物，单、双链 加样： Termina