家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及家蚕遍在蛋白的分离纯化-特种经济动物饲养专业论文.docx

中文摘要遍在蛋I刍(ubiquitin)是一种由76个氨基酸组成的、高度保守的小分子可溶性 中文摘要 遍在蛋I刍(ubiquitin)是一种由76个氨基酸组成的、高度保守的小分子可溶性 蛋白质，存在于各种真核生物的胞质和胞核中。目前所知，遍在蛋自主要通过依 赖ATP的遍在蛋白．蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway，UPP)高效并特 异选择性地对胞质和胞核内蛋自进行部分或完全降解。此外，遍在蛋白还参与核 糖体的生物发生、细胞内吞及其他多种生理功能，并在多种疾病中发挥作用。除 了真核生物以外，昆虫病毒是迄今发现唯一编码遍在蛋白的病毒。 本研究从家蚕核型多角体病毒镇江株(BmNPV-ZJ)基因组中克隆了遍在蛋 白一39K基因片段。测序和生物信息学分析表明，遍在蛋白．39K基因片段包括两 个完整的开放阅读框(0RF)：遍在蛋白 (BmVUB)和39K(BmV39K)；遍在蛋 自的序列与BmNPV-T3株的序列一致， 而与其它昆虫病毒的遍在蛋白序列相差 较大；39K序列与BmNPV-T3相比较有3个核苷酸发生同义突变，与昆虫痘病 毒的39K序列的同源性很低。绘制的分子进化树结果显示，与以昆虫杆状病毒 的其它基因为基础绘制的分子进化树基本一致。BmVUB和BmV39K蛋白质的 二级结构主要由a．螺旋和Random coil构成。BmVUB和BmV39K蛋白均可被小 遍在蛋白相关蛋白suM0)修饰，且BmV39K蛋白被SUMO修饰的概率更高， 说明SUMO修饰在BmVUB和BmV39K蛋白功能的发挥过程中起着一定的作用。 构建了pETBmVUB和pGEXBmVUB两神原核表达载体。原核表达结果表 明，两种融合蛋白的表达量分别占总菌蛋白的50％和35％左右，且均为可溶性 表达。用亲和层析法纯化了两种融合蛋白，并以纯化的His)6-BmVUB融合蛋 白为抗原制备了抗体，并用硫酸铵沉淀和凝胶柱层析法纯化抗体，ELASA测得 抗体的效价达到3x104。Western Blotting检测抗体的特异性较好。 以(His)6．BmVUB融合蛋白为靶标，对噬菌体12肽库进行亲和筛选。利用 ELISA鉴定噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列测定和同源性比较分析、并利用 MTll去测定含结合肽的噬菌体对家蚕BmN细胞生长增殖的作用。结果表明，3轮 筛选后随机挑取20个噬菌体克隆，ELISA鉴定表明204克隆均可与BmVUB结 合。随机挑选10个克隆进行DNA测序并推导其氨基酸序列，10克隆可分为5种氨 基酸序列类型，每一类氨基酸至少含有3个疏水氨基酸。对这10个阳性噬菌体克 隆进一步鉴定，游离BmVUB可阻断10个阳性噬菌体克隆与固相化BmVUB结合。 5种结合肽对BmN细胞生长增殖的影响有很大差异，其qbVAPHHAYAPMRT}]太段 的作用有浓度依赖性，即低浓度时强烈促进细胞的生长增殖，高浓度时强烈抑制 的作用有浓度依赖性，即低浓度时强烈促进细胞的生长增殖，高浓度时强烈抑制 细胞的生长增殖。该结果可为设计针对BmVUB的多肽药物提供技术支持。 改良一种简便的核蛋白抽提方法，利用非放射性Southwestern Blotting从 BraN细胞核蛋白中初步鉴定出两种UB序列特异性DNA结合蛋白，分子量分别 约为66kD和70kD，其结合活性具有特异性，并可被BmVUB竞争抑制。 对原核表达的(His)6．融合蛋白，进行亲和层析、凝胶柱层析和反向HPLC 分离后进入质谱分析。得到的氨基酸序列进行序列比对显示，测得的每条序列都 与已知的遍在蛋白序歹d有同源性，可以确定原核表达的产物即是BmⅥIB。 本研究结果可为进一步开发设计针对UB的多肽药物及病毒UB的作用提供 实验依据。 关键词：家蚕核型多角体病毒，BmVUB，抗体，噬菌体肽库，结合肽，非放射 性Southwestern Blottmg，质谱 ll Ubiquitin(UB)is Ubiquitin(UB)is a small polypeptide of 76 amino acids，which highly conserved in eukaryotes from insects to humans and consist in cytoplasm and nucleolus．UB degradated cytoplasmic and nucleolus proteins efficianfly,particularly and selectively via ATP -dependent Ubiquitin-proteasome pathway(UPP)．UB has many functions，including helping formation o