鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用-预防兽医学专业论文.docx

中文摘要干扰素是一种具有抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节活性的细胞因子，干扰素与干扰素受体 中文摘要 干扰素是一种具有抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节活性的细胞因子，干扰素与干扰素受体 结合后启动信号传导和干扰紊基因的转录。本文克隆并表达了惠阳胡须鸡IFN—a、IFN．B、 IFNARl、1FNAR2基因；首次克隆了鸡IFNGR2全长cDNA；分析了干扰素受体在外周血淋巴细 胞和各器官组织中的分布：并对IFN．a、1FN-B与其受体在体外的相互作用和重组蛋白的二级结 构进行了研究。 以肝脏DNA为模板，克隆了惠阳胡须鸡口附．q基因，与Genbank上]FN-a的同源性为 96．9％--97．9％，是一个新的亚型；克隆了惠阳胡须鸡IFN．B和AA肉鸡IFN．13基因，与白色来 亨鸡IFN-B的核苷酸序列同源性分别为99．84％、100％，目前鸡IFN-B尚未发现亚型的存在。构建 了鸡IFN-o／pGEX-6P．1和IFN．B／pGEX．6P．1重组质粒，在B121中诱导表达，可溶性蛋白通过 亲和层析得到纯化并采用Western．blot得到了鉴定。IFN．a、IFN．B重组蛋白具有较高的生物学 活性，在CEF／VSV系统中的抗病毒活性为7．9x 105U／rag和6．4×10U／mg。 从惠阳胡须鸡肝脏总RNA中扩增了I型干扰素受体的两个亚基：IFNARl、IFNAR2。惠阳 胡须鸡IFN^Ri、IFNAR2分别与红色原鸡的IFNARl、IFNAR2的氨基酸序列同源性为99．47％ 和98．82％，均为新的亚型。在IFNARl氨基酸序列的35．133、134-237、240-319和341—447处有 四个典型的干扰素受体家族的保守性motif：FibronecfinIII型分子，123．129和302-321处有两个 典型的linker；在IFNAR2氨基酸序列的37-93处和129．240处有两个FibronectinIII型分子，在 94．105和157—166处有两个典型的linker。构建了鸡1FNARlEC／pGEX-6P．1、IFNAR2EC／pGEX．6P．1 重组质粒并转化到BL21中诱导表达，可溶性蛋白通过亲和层析得到纯化并采用Western-blot得 到了鉴定。 蛆惠阳胡须鸡脾脏总RNA为模板，采用5’RACE和3 RACE的方法首次克隆了1FN．Y受 体B链全长cDNA序列，共2221bp。这一基因编码334个氨基酸，与小鼠、大鼠和人1FNGR2 氨基酸的同源性分别为29％、28％和30％；在氨基酸序列的31-119和126-217处含有两个 Fibronectln III型分子，在96．115和115—131处有两个linker。将采用RACE克隆的这一基因命名 为惠阳胡须鸡IFNGR2(HuiYang chicken WNGR2)。Ocnomc BLAST的结果显示IFNGR2与 IFNARl、IFNAR2、1L广10R2串联排列于鸡的1号染色体上。 采用Northern杂交和RT-PCR的方法，分析了鸡lFN．Ⅱ、IFN-B、珉淞R1Ec、删AR2Ec 和IFNGR2EC基因在脾脏、胸腺、法式囊、胸肌、心肌、肾脏、肝脏、盲肠扁桃体、未刺激外周 血淋巴细胞(PBL)和ConA刺激PBL中的表达水平。IFN-n、lFN—B基因在组织和未刺激的PBL 中呈关闭状态，在ConA刺激的PBL中表达水平很高。未刺激的PBL中IFNARl、IFNGR2的表 达水平很高，IFNAR2的表达水平较低，ConA率H激后IFNARl、IFNAR2和IFNGR2的表达水平 没有明显上升。在脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体中均可检测到IFNARl、IFNAR2和IFNGR2 的表达；IFNGR2在胸肌、心肌、肝脏和肾脏中表达水平也较高。RT-PCR的结果与Northern杂 交的结果基本一致。鸡IFNARl、IFNAR2和IFNGR2在免疫器官中的表达量较高，表明其参与 机体的抗病毒和免疫调节过程。 分子缔实验和GST融合蛋白结合实验证明，IFN，Ⅱ、1FN．8蛋白均可与IFNAR2EC结台形成 分子缔实验和GST融合蛋白结合实验证明，IFN，Ⅱ、1FN．8蛋白均可与IFNAR2EC结台形成 稳定的二聚体，但不与IFNARlEC结合，IFNAR2EC与1FNARlEC之间也不结合；IFN．a可同 时与IFNAR2EC、IFNARlEC结合形成三聚体，IFN．B也可同时与IFNAR2EC、IFNARIEC结合 形成三聚体。这些结果进一步证明]FN-a／IFN-8与其受体的作用顺序为，／FN．a／IFN-B先与 lFNAR2EC结合，形成的二聚体再与IFNARlEC结合，形成三聚体。 将GST-3C蛋白酶酶切后的IFN