课件：核酸的提取.ppt

Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头，离心管，移液器 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 七、RNA提取常见问题 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 1. RNA 的降解  提取的材料不新鲜。新鲜组织取得后应立即置于液氮中或立即放入RNAstore试 剂中，以保证提取效果。 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 2. OD260 /OD280 比值偏低 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 3.电泳带型异常 非变性电泳： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。 4.下游实验效果不佳 RNA 降解 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA 思考： 如何从总RNA中分离mRNA? 分离的总RNA可利用mRNA 3末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析 * * 还可在提取液中加入5%的PVP40（聚乙烯吡咯烷酮）， * * * * * * * * * * * * * RNA 2.消除Rnase的活性方法： （1）对于外源Rnase： 器皿和材料 塑料器皿（如离心管、Tip头、eppendorf管） 其它不能用高温烤的材料。 DEPC（焦碳酸二乙酯）： 0.1%DEPC水37℃浸泡2小时以上，并经高压灭菌； 碘乙酸水溶液 氯仿 RNA 玻璃器皿： 200℃干烤6-12 h 器皿和材料 RNA 加入DEPC至 0.1%浓度 然后剧烈振荡20min或室温过夜 ? 煮沸15min或高压灭菌以消除残余的DEPC 试 剂 ① 否则DEPC与腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。 DEPC是Rnase的化学修饰剂，它与Rnase的活性基团组氨酸咪唑环反应而抑制Rnase的活性。 RNA （2）对于内源Rnase： 根据实验特点采用不同方法： 如体外转录等实验中加入Rnase的专一抑制剂(Rnasin)： 对于RNA的分离制备可采用非特异的蛋白变性剂、蛋白酶K、阴离子去污剂。 二、实验原理 细胞内RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。 制备RNA时，必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。 由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和苯酚法。 异硫氰酸胍/苯酚法（Trizol法）原理 裂解细胞：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； b. 沉淀Pro等