课件：流式细胞技术及其应用.pptVIP

§4.1.7 免疫表型分析的影响因素 抗体的用量：使用抗体浓度＞3μg/ml时，表明抗体的亲和力或特异性低，最好不用。 最佳浓度一般为0.01~1 μg/ml，相当于每个测试10~100ng。 非特异性结合（NSB）：是指非抗原抗体的结合。Fc受体结合抗体是导致其重要因素。任何细胞上只要存在未结合的Fc受体，都可能有NSB。采用高浓度的纯化鼠IgG可用于阻断Fc受体的NSB。免疫球蛋白聚集可增加NSB。由于冰冻、复溶和冻干处理，抗体均可出现聚集。对于新近购买的抗体，可通过高速离心去除聚集。 抗原抗体反应温度：一般在室温条件下进行。 死细胞：可增加抗体的非特异结合。因此，标本采集后应尽快进行荧光染色，固定后的保存时间可相对较长。此外，也可在标本制备前计数死细胞的百分率。 §4.2 细胞周期与DNA倍体分析 在生物细胞核中，DNA含量并非恒定，随细胞增殖周期时相不同而发生变化。 整个细胞周期从DNA含量变化可以描述为G0/G1、S、G2/M期三个细胞峰。 G0/G1期细胞的DNA含量相同，均为二倍体DNA含量。 G2/M期细胞的DNA含量均为四倍体DNA含量。 §4.2 细胞周期与DNA倍体分析 § 4.2.1 FCM分析的基本方法 荧光染料（如PI）与细胞DNA分子特异结合，而且有一定的量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料结合量成正比，荧光强度与荧光直方图的通道数成正比。 在流式细胞分析DNA中，只有在染色体数目变化引起DNA含量与正常细胞有差异时，才可能有DNA异倍体检出。在DNA含量未见异常并不能除外染色体异常的存在。 § 4.2.2 DNA含量的表示方法 细胞群的DNA含量在FCM分析中一般以DNA指数（DNA index，DI）表示其相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其 G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值1.0。 DI=样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数/正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数 §4.2.1 DNA倍体的判定标准 倍体（ploidy）原指染色体数目。 流式细胞分析中用来描述总的 DNA总量。 根据DI判定DNA倍体。 DI=1.0±0.1（0.90～1.10）为二倍体 DI=1.0±0.15（0.85～1.15）为近二倍体 DI=2.0±0.1（1.90～2.10）为四倍体 DI＞2.10为多倍体 其余DI值均为非整倍体 1. 单细胞悬液制备 新鲜或新鲜冰冻标本： 白血病标本、穿刺液很容易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。 新鲜固定的标本： 标本切成1～2mm2的小块，在含胃蛋白酶的0.1mol/L HCl液中孵育或用胰蛋白酶处理，使其释放细胞核。 甲醛固定、石蜡包埋的标本： 从包埋组织上切片至少50μm厚，太薄的切片会含有太多切碎的核，从而增加DNA直方图的碎片干扰。组织切片被脱蜡、经过乙醇处理并水化后，用蛋白水解酶处理，使其释放细胞核。 §4.2.2 样本制备 2． 固定 采用70%预冷乙醇(0~4°C)。 运送标本时应保证样本完全浸没在固定剂中。 由于PI不能通过活细胞进入胞内染色，因此要用乙醇将细胞膜打孔，把染料引入胞内并将细胞固定。 若同时使用抗体鉴别细胞应选择对抗原无损的固定剂，并在抗体标记之后进行固定。 §4.2.2 样本制备 §4.2.2 样本制备 3．染色 应用PI染色液。染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度至少为20ug/106细胞。 由于PI也与双链RNA结合，分析前样本应用RNase处理。 细胞用50um尼龙网过滤后上机检测。 4．细胞浓度 单细胞或细胞核的最终浓度应为 106/ml。浓度太低时，流式细胞仪检测室样本的流速不得不提高，从而使CV增大。如果细胞或细胞核浓度太高，则可能导致染料的相对不足，影响CV和检测结果。 流式细胞分析的高分辨率或精密度可检出不同细胞群体DNA含量的细微差别，通常的检测分辨率或精密度由DNA含量直方图中G0/G1峰的变异系数（CV）来反映。CV越小，质量越好。新鲜标本CV常≤3%，石蜡包埋标本的CV≤5%。 §4.2.2 样本制备 §4.2.2 样本制备 5．样本制备的质量 制备完成后的标本可用光学显微镜检查其质量，注意观察： 样本中细胞或细胞核浓度 细胞聚集或过多的碎片 大多数核有肿瘤样的外观 分离的核上没有参与细胞质附着 §4.2.3 样本分析 §4.3 细胞凋亡