4.1.第四章基因工程的主要技术及其原理1.ppt

第一节 DNA和RNA的提取和纯化 第二节 凝胶电泳 第三节 核酸和蛋白质的分子杂交 第四节 聚合酶链式反应技术 第五节 DNA序列分析 第六节 基因定点诱变 第七节 DNA与蛋白质互作分析 ;本章重点掌握的内容1;第一节??DNA和RNA的提取和纯化 ;第一节??DNA和RNA的提取和纯化;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;碱裂解法是利用共价闭合环状质粒与线性染色质体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。 ;溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mMTris-HCl pH8.0 ) 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活。 溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS, 现用现配) 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III (3M乙酸钾溶液,pH=4.8) 作用：中和NaOH，使质粒DNA复性，变性蛋白－SDS和线性DNA沉淀。;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;一、DNA提取的基本原理与方法;二、总RNA提取的基本原理与方法;目的组织;二、总RNA提取的基本原理与方法;注意： 提取过程应尽量保持低温 所用试剂均要求无菌！！！且忌交叉污染！！！;三、质量检测和相对分子质量的测定 ;质量检测（浓度和纯度）———紫外分光光度法 测DNA：;质量检测（浓度和纯度）———紫外分光光度法 测RNA：;相对分子质量的测定和分离 ———凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖变性胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲电场凝胶电泳 凝胶电泳中DNA的检测 ;;;一、PCR扩增原理;一、PCR扩增原理;二、PCR体系;二、PCR体系;二、PCR体系;二、PCR体系;三、PCR引物设计原则;三、PCR引物设计原则;三、PCR引物设计???则;四、PCR技术类型/应用;四、PCR技术类型/应用;四、PCR技术类型/应用;四、PCR技术类型/应用;四、PCR技术类型;四、PCR技术类型/应用; 实时定量PCR (real-time quantitative PCR) PCR：对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。无论定性还是 定量分析，分析的都是 PCR 终产物。 ; 实时定量PCR (real-time quantitative PCR) 荧光基团： 内掺式染料 SYBR Green I 探针 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) ;相对分子质量的测定和分离 ———凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖变性胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲电场凝胶电泳 凝胶电泳中DNA的检测 ;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;二、琼脂糖变性胶电泳 ——RNA电泳;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳——PAGE;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳;四、脉冲电场凝胶电泳—— PFGE;第六节 基因定点诱变;一、盒式诱变——DNA片段取代法;二、???核苷酸引物诱变;三、PCR诱变;三、PCR诱变