课件：免疫学技术.pptVIP

酶标仪使用方法:1.打开主机及打印机电源开关,仪器进行 约30秒左右的自检,显示基础酶联2.按测量模式,选择单波长检测,输入所需 波长(405、450、492、540、630nm) 3.通过↑、↓选择有无试剂空白及空白孔 位置(单孔、列、列平均、行、行平均 ), 然后选择每板都带空白4.机器回到主界面,添加打印纸,放置酶标板, 按开始键,30秒左右检测完毕自动打印数  据 酶标仪使用注意事项: 1.先开主机电源,再开打印机电源2.小心操作,以防将液体溅到机器上3.酶标板放平,对好位置 4.用后关机并登记 分光光度计使用方法:1.打开电源开关,机器约3分钟初始化2.在机器主界面按goto键,设置所需波长，按  确认键3.按shift/return键，进入系统设置界面，按▼ 键选择样品池个数 4.设置样品池后,按shift/return键回到测量界面, 在1号样品池放入空白对照,按zero进行空白 校正5.自动校零后,在2号样品池放入样品,按start键 进行测量6.记录测量数据,退出程序,取出比色皿清洗干 净 分光光度计使用注意事项：1.如测量中更换波长,要重新空白校正2.及时记录测得数据,退出程序或关机后不保 存数据3.每次测完后取出比色皿,清洗干净4.用后关机登记 谢 谢！ 免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识 免疫组化结果判断原则 ⑴.必须设染色对照 每批染色都要以特异性阳性对照和阴性对照为基础.没有阳性对照 就不能做出真正阴性结果的判断;没有阴性 对照,也就不能做出真正阳性结果的判断. 没有对照的免疫组化结果是不可信的 ⑵抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位,如LCA在细胞膜上、S-100蛋白在胞浆和胞核内,不在抗原所在部位的阳性表达不能视为阳性 ⑶阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果不能认为具有否定意义;阳性表达有强弱、多少之分,只有少数细胞阳性（在抗原所在部位）也要视为阳性表达 引起假阴性和假阳性结果的原因 假阴性结果的原因主要是： （1）抗体已失活或浓度不当 （2）组织自溶(抗原扩散)导致抗原消失,特别 长期固定标本,应多用新鲜标本 （3）操作步骤不当,如反应时间不够或过久、 洗脱不够或温度过高 （4）组织或细胞中抗原的含量很低 假阳性结果的主要原因（1）所用的抗体有交叉反应,特异性差，特 别应用多克隆抗体时更易出现（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片 干燥导致抗体与组织产生非特异性结合（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、 碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性 显色 免疫组化操作经验和体会 操作注意问题： 1.石蜡切片和冰冻切片均可,要注意防止脱片 2.充分消除内源性过氧化酶和非特异性染色 3.PBS洗涤要充分 4.要设阴性和阳性对照 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制 6. 消除内源性生物素活性:先以 0.01%抗生物 素溶液作用切片20min7.ABC复合物应在临用前30min配置8.ABC试剂保存温度为4℃ 9.抗体保存：-20℃ 分装冻存,或于4℃ 常规使 用,切忌反复冻融 免疫组化常遇问题 1 .均匀的背景染色:酶-底物反应时间过长、孵育切片干燥、一抗或二抗稀释度不够、切片洗涤不充分、封闭用的正常血清不对 2 .部分区域背景着色:切片部分区域干燥、显色反应物在封片介质中可溶、造成弥散 3 .部分区域不着色:脱蜡不完全 、切片部分区域干燥 4.各种孵育结果所有抗体均不着色 :H2O2终浓度不够或存放过久、稀释液中有错误的正常血清、显色反应物溶于脱水的酒精及二甲苯或封片液 5.某些抗体不着色:需要消化而没有消化、封闭内源酶时使抗体活性下降、切片在裱片或干燥时过热、抗体过度稀释、一抗浓度小于二抗、抗体过期或频繁冻融 6. 内源性酶活性:H2O2 -甲醇封闭不当 7. 脱片:切片无粘附试剂、切片不干净、组织 在贴片前已经充分固定 8. 核轮廓模糊:切片已干燥、苏木素染液欠佳 9 . 非特异性染色:底物未过滤、抗体未离心 10.阳性反应太弱:抗体或其它试剂活性下降、 显色反应时间过短、抗体的稀释度或孵育 时间不够、加抗体时切片上缓冲液过多 11 .切片镜下模糊或黑点沉着:脱水不彻底、 进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯 混合液、温箱干燥替代脱水过程 Ⅲ 免疫荧光标记技