ChIP实验精讲(做科研的必看).docVIP

染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理 在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP应用 1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系； 2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； 3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； 4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。 试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项： ①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。 ②交联的时间很关键。交联的时间一般为2-30 分钟。 ③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。 ④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。1.1 取 1直径10cm培养皿的细胞。加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。1.2 室温下，轻摇10 分钟。1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS， 刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至 50ml 离心管中。1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。1.8 吸弃上清，用 SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加 800 μl）。SDS Lysis Buffer配方：50 mM HEPES-KOH pH7.5140 mM NaCl1 mM EDTA pH81% Triton X-1000.1% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors (每次新鲜加入)注意事项：使用悬浮细胞实验时，加入0.75% （v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分钟，1000g离心沉淀细胞。冰冷 PBS 洗 3 次，用 SDS Lysis Buffer重悬细胞（每 1 X 107 细胞加 800 μl）。 组织免疫沉淀样品的制备 注意事项：①每个IP反应建议使用肝组织 30 mg，可按实际情况调整。 ②每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。 ③每个IP反应最适染色质的量为5-15 μg 。 ④每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。 ⑤所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂protein inhibiter （cocktail）。2.1. 交联反应 注意事项： ①冰冻组织应置于冰上融化。 ②冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。 ③操作过程中要一直在冰上进行，尽量缩短操作时间防止蛋白降解。2.1.1.将冰冻或新鲜组织切成小块(1-3 mm3) 。2.1.2. 取一个空的15 ml 离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。2.1.3.每克组织加10 ml PBS。加入终溶度1.5% (v/v) 的甲醛，室温旋转15 分钟。2.1.4. 加入甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应，室温旋转5 分钟。2.1.5. 4 °C，720 rpm，离心 5min。2.1.6. 弃上清，用加入10ml 预冷的PBS 洗涤。4°C，720rpm，离心5 min，弃上清。注意事项： ①所得组织可用液氮速冻，保存于 -80 °C。 ②避免反复冻融。 ③使用时可用预冷PBS 重