建立宫内移植小鼠嵌合模型研究外源干细胞的体内行为-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

上海第二医科大学博士论文建立同种异体干细胞宫内移植小鼠嵌合模型 上海第二医科大学博士论文 建立同种异体干细胞宫内移植小鼠嵌合模型 研究外源干细胞的体内行为 中文详细摘要 对先天性和遗传性疾病的治疗一直是临床医生面临的难题之一。随着科学技 术的进步和分子病理、分子诊断学的迅速发展，许多先天性／遗传性疾病已经可以 在妊娠早期得到确诊，使医生有可能在病儿出生之前采取相应的治疗措施，即进 行产前治疗，从而防忠于未然。采用异源的干细胞进行宫内移植是产前治疗的重 要方式之一。但是由于人们对干细胞移植后的归巢、分化和增殖等特性的了解甚 少，所以这方面的进展缓慢。建立宫内移植的动物模型对于了解干细胞移植后的 体内行为，促进产前治疗的发展具有重要价值。 本研究用宫内移植的方法将干细胞植入胎鼠腹腔，以雄性小鼠和本所构建的 转基因小鼠的骨髓作为干细胞的来源，在受体鼠出生后应用分子生物学和细胞生 物学的多种手段进行检测，成功建立了同种异体的小鼠嵌合模型；同时对模型鼠 体内的外源细胞的分布和嵌合量及维持时间进行观察和比较，为研究产前治疗和 干细胞的体内行为(in vivo)提供了有效的动物模型和科学的实验数据。主要工作 分为三部分： 一建立了嵌合有外源雄鼠细胞的宫内移植的小鼠模型 从正常青龄雄鼠长骨骨髓分离单核细胞，在孕13．5天经孕母鼠子宫壁将单核 细胞注射到胎鼠腹腔，每只受体胎鼠注入1×105个细胞。在受体鼠出生后，以雌 性受体鼠作为分析对象，检测它们的嵌合情况。结果如下： 1．根据雄鼠Y染色体上的特有序列设计特异性引物，进行PCR扩增检测受 体雌鼠外周血中的雄鼠细胞；结果检测到4只雌性嵌合鼠，占所有活产受体雌鼠 的17．4％： 2．在受体雌鼠4月龄和6月龄时再次取外周血，进行定量PCR检测，结果发 现仍有3只受体雌鼠的外周血中存在外源的雄鼠细胞，4月龄时的阳性受体鼠外周 血的最高嵌合量为8．24％o，6月龄时最高嵌合量为7．22个／万。 上海第二医科大学博士论文3．采集阳性受体鼠的外周血和骨髓分离有核细胞，以雄鼠的全Y染色体涂染 上海第二医科大学博士论文 3．采集阳性受体鼠的外周血和骨髓分离有核细胞，以雄鼠的全Y染色体涂染 探针进行荧光原位杂交实验(FISH)，结果在6月龄的阳性受体雌鼠的外周血和骨 髓中也检测到有雄鼠细胞的存在，进一步证实了分子检测的结果，说明已经建立 了体内长期(≥6月)嵌合有外源雄鼠细胞的宫内移植的动物模型。 二建立了嵌合有转基因鼠细胞的宫内移植小鼠模型 1．本部分的研究中采用本所自行构建的在红系特异表达绿色荧光蛋白(GFP) 的转基因小鼠作为细胞供体进行宫内注射，同时将单核细胞的植入量增加到2× 105个／月台鼠。 受体鼠出生后4周抽提外周血DNA，PCR扩增GFP序列，结果在50只受体 鼠中有14只阳性的嵌合鼠，嵌合率为28％，高于第一部分实验得到的嵌合率。同 时根据GFP序列设计了TaqMan探针进行定量PCR检测，一方面验证了前面的定 性PCR结果，同时确定了14只鼠的外周血嵌合量。结果表明：14只小鼠的外周 血嵌合量平均为O 954％(2．68％，o 767％，0 336％，o 837％，1 66％，O 919％， O 287％，O 379％，O 77％，2 23％，O 442％，0 537％，l 41％，0 107％)。 因为供体转基因小鼠在红系表达GFP，为了观察受体鼠血中的外源细胞，我 们在荧光显微镜下观察受体鼠的外周血涂片，结果在14只阳性受体鼠的外周血均 观察到有表达绿色荧光蛋白的红细胞存在。用流式细胞技术对阳性受体鼠外周血 GFP细胞进行定量，结果显示14 Rd,鼠GFP红细胞的含量平均为2 57％(7．14％． O 59％，1 04％，2 17％，2 49％，3．74％，1 33％，0 71％，1 43％，l 31％，4 14％，2 65％， 4．22％，3．08％)。另外用FISH技术对6月龄的阳性受体鼠的外周血和骨髓进行检测， 结果进一步证实受体鼠中存在外源的细胞。 以上结果均证明通过宫内移植的方法成功建立了嵌合有外源GFP细胞的小鼠 模型，并且外源的细胞可以在受体内长期(≥6月)存在。 2．用磁珠分选技术将供体小鼠骨髓的单核细胞进一步纯化，得到Sca．1+细胞 用于宫内注射，注射细胞量为2×104个／胎鼠。在受体鼠出生后1月进行检测，结 果在35只活产受体鼠有3只嵌合有外源细胞，嵌合率为8．6％。同时进行的宫内 注射Sca—l一细胞的对照组没有得到阳性嵌合鼠。Sca一1+细胞注射组的产崽率与单纯 注射培养基的对照组没有显著差异，说明Sca．1+细胞对受体胎鼠的损伤作用较小。 定量PCR确定三只阳性受体鼠的外周血嵌合量分别为l 71％o，8．31‰，3．220／oo，平 均嵌合量为4．41％o