基因工程基本操作程序 (1).pptVIP

为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。 构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。 1.用一定的_______切割载体，使其出现一个切口，露出_______ 。 2.用___________切断目的基因，使其产生__________。 —— 核心 3.将切下的目的基因片段插入载体的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同的黏性末端 切口 DNA连接酶 二、基因表达载体的构建 DNA连接酶 基因表达载体的组成： c 、目的基因 b、启动子 d 、终止子 e、标记基因 a、复制原点 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 三、将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。 将目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 转化—— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 —— 感受态细胞吸收DNA分子 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上 基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加表达载体-DNA ，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 显微注射法 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 2.微生物作受体细胞原因： 将目的基因导入微生物细胞 3.转化方法： 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 1.常用菌： 感受态大肠杆菌细胞 Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。 DNA分子导入受体细胞后就说明目的基因完成了表达吗？ 　　例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 (四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 分子 检测 个体 鉴定： ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 方法—— 方法—— 方法—— DNA分子杂交 分子杂交 抗原-抗体杂交 DNA 附着在膜上 硝化纤维素 加探针 含荧光素分子 变性 DNA杂交 （如检测SARS病毒等） a b c d 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。 无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定 思考：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 2.根据农杆菌可