基因分析基本策略.pdfVIP

第十一章 基因分析的基本策略 111 从上世纪70年代以来，与DNA、RNA操作相关的各 种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个 庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的 重要手段。简单地说，基因操作就是所有涉及到DNA、 RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析。 222 对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤： 1、需要进行基因的DNA序列分析:序列测定 2、基因的染色体上定位：原位杂交技术 3 、研究基因在基因组中的拷贝数：Southern Blot 4、研究基因表达水平：Northern Blot 、逆转录实 时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平：Western Blot 、流式 细胞仪（FACS ） 333 第一节 利用DNA定性、定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究 一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化 DNA测序技术： 1、双脱氧链终止法(Sanger法) 2、化学裂解法 3、PCR测序技术 4、全自动DNA测序仪 这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 444 双脱氧测序方法原理 Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2 ˊ,3 ˊ-ddNTP ）作为链终止剂。2 ˊ,3 ˊ-ddNTP脱氧核糖 的3 ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3 ˊ羟基形成磷酸二 酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸 终止。 如果在DNA 的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核 苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核 苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的 ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A ，G， C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳，就可读出序列。 555 666 777 化学裂解法（Maxam-Gilbert ）1977 基本步骤： 32 35 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素（ P、 S）， 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、 不完全的化学修饰； 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断 开DNA链； 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺 凝胶电泳，将DNA断裂片段按分子大小分离开 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情 况，直接读出DNA序列。 888 反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点 试剂 反应 试剂 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C/T C