沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术规范性审查稿.docVIP

ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T XXXXX—XXXX □□沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术 □□ Loop-mediated isothermal amplificationfor Salmonella typhimurium and Salmonella choleraesuis XXXX-XX-XX 实施XXXX-XX-XX XXXX-XX-XX 实施 山东省质量技术监督局 发布 本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准山山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：黄保华、时建立、李俊、彭甜、刘畅、朱荣生、徐绍建、丛晓燕、杜以军、吴 家强、孙文博。 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温 扩增检测技术扩增检测技术 1范围 本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)的坏介导等温扩增(LAMP)检测技术的要求。 木标准适用于疑似污染鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的各种样品检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注FI期的引用文件，仅所注H期的版本适用于本文 件。凡是不注LI期的引用文件，其必威体育精装版版木(包括所有的修改单)适用于木文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB 4789. 4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验 3材料 3.1器材 1. 1微蜃移液器(最人量程分别为10nL 20uL、100nL. 1000uL) 1.2 20000g低温高速离心机 1.3电热恒温水槽 3.1.4稳流稳压电泳仪 1.5水平电泳槽 3.1.6凝胶成像系统 3.1.7紫外透射反射分析仪 1.8电磁炉 1.9 烧杯(lOOOmL) 3.2试剂 3. 2. 1 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A. 1 3.2.2 Bst DNA Polymerase (8U/U L) 3. 2. 3 SYBR Green I 核酸染料 3.2.4 0.5XTBE缓冲液：配制见附录A?2。 3. 2. 5 1%琼脂糖电泳液：配制见附录A. 3o 10 mg/mL的漠化乙锭(EB)水溶液。 DNA Marker 2000。 3. 2. 8 超纯水：符合GB/T 6682要求。 3.3引物 鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测引物： F3： 5 - CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG-3? B3： 5 - CGTGAGATATCGTCCAAAAGG -3 FTP： 5 - GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC -3 BTP： 5 - AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC -3 猪霍乱沙门氏菌LAMP检测引物： F3： 5 - GGAGGAAGGTAGGGATGACG -3 B3： 5 - CACTCCCATGGTGTGACG -3 FIP： 5 - TCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTT-CCCTTACGACCAGGGCTA -3 BTP： 5 - CGGATTGGAGTCTGCAACTCGA-GGAACGTATTCACCGTGGC -3 4方法 1样品处理及DNA的提取 样品前处理及增菌按照GB 4789. 4-2010中5. 1、5. 2操作。取1 mL增菌液放入1. 5毫升EP管中,10 000 r/min离心2 min,去上清；加入灭菌生理盐水1 mL混匀,10000 r/min离心2 min,去上清；然后加灭菌 双蒸水1 mL混匀，，放入沸水浴中煮沸lOmin,取出后迅速放入冰块中,冷却5min, 12000rpm,离心3min, 吸上清液作为DNA模板，并保存于-20°C备用。 4.2环介导等温扩增(LAMP)操作流程 2.1环介导等温扩增反应体系配制 按表1中1-8的循序配制。 表1环介导等温扩增反应体系 10X ThermoPoldMTP 混合液 10X ThermoPoldMTP 混合液(10nimol/L)B3/F3(5umol/L)BlP/FlP(50ymol/L)Betaine (5mol/L) 2.5 uL 0. 15 PLX2 1.5 u LX2 3. 0 uL 1.0 u L 10.2 uLBst DNA Polymerase(8U/u L) 超纯水 10.2 uL 2.2 LAMP程序设定 每次LAMP均应设一个阴性对照（川超纯水作