HPLC及HPLCMS分析方法的开发及其在药物分析中的应用.ppt

* 流动相pH值 影响带有可离子化官能团的分析物 胺 羧基 酚 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团 改变流动相pH将使选择性发生极大改变 * 流动相pH值 酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响 Silica pH Range Hybrid Particle pH Range Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39. pH 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 12 Retention Factor (k) 酸性 碱性 中性化合物 碱性保留增强 [B] 酸性保留增强 [HA] * 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, ACN I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N] 碱性及中性化合物 * 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 I A P Fl Fe D O Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH P C18 pH 3, ACN I A P Fl Fe D O I A Fl Fe D O C18 pH 10, ACN Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH I A P Fl Fe D O Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A] 酸性化合物 * 固定相、溶剂和流动相pH的影响因素 分析物在其未电离[中性]状态时保留较强 甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性 当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变 在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变 最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时 * 梯度洗脱 优点 单位时间的分离能力增加－较大的峰容量 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 色谱柱需再生 定量分析的重复性较低 * 梯度洗脱 高压梯度及低压梯度 溶剂 A 溶剂 B 泵 A 泵 B 混合器 A 高压梯度 溶剂 A 泵 溶剂 B 比例阀（溶剂混合点） 混合器 B 低压梯度 （溶剂混合点） * 梯度洗脱滞后体积 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 滞后(系统)体积 滞后(系统)体积 溶剂输送系统(泵) 检测器 进样器 色谱柱 梯度混合器 溶剂输送系统(泵) 高压梯度 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！ 比例阀 检测器 进样器 A B C D 色谱柱 溶剂输送系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 * 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为 2.0ml，流速1.0ml/min时梯度晚2分钟 如流速为0.1ml/min，实际梯度晚20分钟 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献值大或小都使方法不能重现 普通HPLC的滞后体积为2~4ml 对分析型HPLC没有影响 对作微柱实验用梯度时影响较大 梯度洗脱滞后体积 * 液相色谱的分离机理 从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受 从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合 HPLC及HPLC/MS分析方法的开发及其在药物分析中的应用 * 基于分离分析科学技术 小颗粒填料的色谱柱 以光谱、质谱技术作为检测手段 专属性、分离效率及灵敏度 适用于广泛的色谱应用 适用于开发新方法 适用于现有方法的改进 HPLC及HPLC/MS法 * 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。 分析方法学的开发及验证 * 方法开发 实验室获得方法及运用过程 方法验证 方法确认 方法转移 准确度，精密度，专属性，检测限，定量限，线性，范围，耐用性 分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等）及优化（梯度、柱温、流速等） 法定检验方法在使用环境中适用性评估（人员、仪器、样品、试剂）