pak4在乙型脑炎病毒感染介导神经胶质细胞炎症反应中的作用研究预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．2 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．2 实验方法 一17 3．2．1 病毒增殖及病毒滴度测定 17 3．2．2 细胞培养 17 3．2．3 细胞转染 17 3．2．4 细胞感染JEV 18 3．2．5 荧光定量RT．QPCR检测基因mRNA 1 8 3．2．6 质粒的构建 20 3．2．7 细胞总蛋白的提取 23 3．2．8 细胞核蛋白的提取 24 3．2．9 Westem Blot分析 24 3．2．10间接免疫荧光 24 3．2．11统计学分析 25 第4章结果与分析 。26 4．1 JEV对U251细胞感染效率的检测 26 4．2 JEV感染对U25 1细胞中PAK4蛋白磷酸化水平的影响 27 4．3 抑制内源性PAK4的表达对JEV介导炎症反应的影响 ．29 4．4 过表达PAK4蛋白对JEV介导炎症反应的影响 -31 4．4．1真核表达质粒PAK4一pcDNA3．1的构建 31 4．4．2 PAK4蛋白过表达对JEV介导炎症因子表达的影响 33 4．5 PAK4对JEV介导的ERK和P38MAPK激活的影响 ．34 4．6 PAK4对JEV介导的NF—KB和AP一1激活的影响 。36 第5章讨论 38 5．1 乙脑病毒调控PAK4的蛋白磷酸化及其机制 。38 5．2 PAK4蛋白调控JEV介导的炎症反应 一39 5．3 PAK4蛋白调控JEV介导炎症反应分子机制的分析 。39 结 论 ．42 发表论文． 51 致谢 一52 万方数据 PAK4在乙型脑炎病毒感染介导神经胶质细胞炎症反应中的作用研究摘 PAK4在乙型脑炎病毒感染介导神经胶质细胞炎症反应中的作用研究 摘 要 乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种虫媒性人兽共患病病原。 该病毒可靶向中枢神经系统，引起乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，严重危害 人畜健康。引起中枢神经系统“炎症风暴”是JEV致病的主要因素，但其分子机制 仍有待研究。p一21活化激酶(p21．activated kinase，简称PAK)是一种富含丝氨酸／ 苏氨酸的蛋白激酶，可作为小G蛋白Cdc42、Rael下游重要的效应分子，在细胞信 号转导、基因转录以及细胞凋亡方面发挥重要作用。ERK是PAK4的下游介质，PAK4 可以通过介导ERK磷酸化从而激活下游NF—r,B信号通路，提示PAK4可能是一种 与炎症反应相关的蛋白。本研究以神经胶质细胞中PAK4蛋白为研究对象，探索其 在JEV诱导炎症反应中作用机制。具体内容如下： 1．JEV感染对PAK4表达及磷酸化修饰的影响 在感染JEV的人胶质细胞系U251中，通过westem—blot方法，检测PAK4蛋白 以及磷酸化修饰的水平。发现，JEV感染可以上调PAK4蛋白磷酸化修饰，但对PAK4 蛋白表达水平没有明显的调控作用。 2．PAK4对JEV介导炎症反应的影响 在U251细胞中，利用siRNA抑制PAK4表达，发现PAK4抑制表达后，JEV介 导的炎症因子的表达显著下降，说明PAK4对JEV介导的炎症反应具有正向调控作 用。 3．PAK4调控JEV介导炎症反应的分子机制 在U251细胞中抑制PAK4表达后接种JEV，发现抑制PAK4表达能够显著下调 JEV介导的ERK磷酸化水平；同时我们也检测了MAPK家族中的另一成员 P38MAPK，发现抑制PAK4表达后JEV介导的P38MAPK磷酸化同样显著下调；进 一步检测PAK4对JEV介导的NF．r．B和AP—l转录活性的调控，发现Pfu“siRNA 能够显著抑制JEV介导的NF—rd3入核以及AP一1的磷酸化。以上结果表明，PAK4 可以通过激活ERK和P38MAPK及下游NF一1出和AP一1信号通路促进JEV介导的炎 症反应。 本研究首次发现了JEV感染可以上调人胶质细系U251中PAK4的磷酸化修饰水 万方数据 华中农业大学2016届硕上研究生学位论文平，并且PAK4可以通过激活MAPK—_NF—rd3／AP一1信号通路促进JEV介导的炎症 华中农业大学2016届硕上研究生学位论文 平，并且PAK4可以通过激活MAPK—_NF—rd3／AP一1信号通路促进JEV介导的炎症 因子表达。该发现为阐明JEV诱导神经炎症反应的分子机制提供了新的科学依据， 也为发掘乙型脑炎治疗新靶标提供了重要线索。 关键词：JEV：PAK4：NF—rd3：ERK；P38MAPK；炎症反应 万方数据 PAK4在乙型脑炎病毒感染介导神经胶质细胞炎症反应中的作用研究Abstract PAK4在乙型脑炎病毒感染介导神经胶质细胞炎症反应中的作用研究 Abstract Japanese enc