men1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究动物营养与饲料科学专业论文.docxVIP

目录中文摘要 目录 中文摘要 ．I Abstract ． ．．． ． III 1前j占． ． ． ．．1 1．1乳腺 ．1 1．1．1乳腺的结构和功能 l 1．1．2乳腺的发育和泌乳过程 ．．1 1．1．3泌乳周期内乳腺细胞的增殖和凋亡 ．．1 1．2细胞周期 。2 1．2．1细胞周期时顺调控机制 2 1．2．2细胞周期监控机制 5 1．3 MENl基因研究进展 。5 1．3．1 MENl基因概述 5 1．3．2 Menin与转录调节 6 1．3．3 Menin与基因组稳定 6 1．3．4 Menin与细胞增殖 7 1．3．5 Menin与细胞凋亡 8 1．3．6 Menin与细胞周期 8 1．4 Merlin与乳腺 ．．9 1．5本研究的目的意义 ．9 2材料与方法 9 2．1试验材料 ．．9 2．1．1奶牛乳腺组织 9 2．1．2主要仪器 10 2．1．3主要试剂及来源 ．10 2．1．4常用试剂的配制 11 2．2试验方法 11 2．2．1奶牛MENl基因过表达载体的构建 ll 2．2．2 siRNA的构建 ．15 万方数据 2．2．3无内毒素质粒大量提取 2．2．3无内毒素质粒大量提取 15 2．2．4奶牛乳腺上皮细胞系的培养 16 2．2。5中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养 17 2．2．6小鼠成肌细胞(C2C12)培养 ．17 2．2．7奶牛乳腺上皮细胞的生物学性状检测 ．17 2．2．8转染奶牛乳腺上皮细胞系 18 2．2．9转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 1 8 2．2．10转染小鼠成肌细胞(C2C12) 19 2．2．11组织／细胞总RNA提取与检测 ．．19 2．2．12荧光定量PCR ．21 2．2．13 W|estern blot ．23 2．2．14 CCK．8法检测细胞增殖 ．．25 2．2．15流式细胞术检测细胞周期 ．．25 2．3统计分析 26 ：；Il占!果 ．．． ．．． ． ．．．．：}6 3．1不同泌乳阶段奶牛乳腺组织MENl／menin的表达分析 26 3．1．1不同泌乳阶段奶牛乳腺组织MENl mRNA的表达分析 ．．26 3．1．2不同泌乳阶段奶牛乳腺组织menin蛋白的表达分析 27 3．1．3不同泌乳阶段奶牛乳腺组织menin蛋白的表达部位分析 27 3．2奶牛MENl基因真核表达载体的构建 ．．28 3．2．1 MENl基因的PCR扩增结果 28 3．2．3重组质粒的测序鉴定 29 3．3奶牛乳腺上皮细胞(MAC．T)的生物学性状检测 ．．29 3．3．1奶牛乳腺上皮细胞的形态观察 ．29 3．3．2奶牛乳腺上皮细胞生长曲线 30 3．4真核细胞奶牛Menin过表达转染体系的建立 ．．31 3．4．1 MAC—T细胞转染pcDNA3．1-MyC-His—bmenl载体最佳条件的确定 ．3 l 3．4．2 CHO细胞转染pcDNA3．1-Myc—His—bmenl载体最佳条件的确定 ．．32 3．4．3 C2C12细胞转染pcDNA3．1-Myc-His—bmenl载体最佳条件的确定 34 3．5 MAC．T细胞中转染siRNA条件的确定 ．36 万方数据 3．5．1 3．5．1 MAC．T细胞转染siI斟A后MENl mRNA的表达分析 38 3．5．2 MAC．T细胞转染siRNA后Menin蛋白的表达分析 ．38 3．6 Menin过表达对MAC．T细胞的影响 ．．40 3．6．1 Menin过表达对MAC．T细胞增殖的影响 - 40 3．6．2 Menin过表达对MAC．T细胞周期的影响 40 3．6．3 Menin过表达对细胞周期相关因子的表达分析 ．42 3．7 Menin限量表达对MAC．T细胞的影响 。42 3．7．1 Merlin限量表达对MAC—T细胞增殖的影响 42 3．7．2 Menin限量表达对MAC．T细胞周期的影响 43 3．7．3 Menin限量表达对细胞周期相关因子的表达分析 ．45 4讨论 ． 。。 ．。． ．．， 。 ，． 。 46 4．1 MENl／Menin在奶牛不同生理阶段的乳腺组织中的表达 46 4．2真核细胞中奶牛MENl／Menin过表达转染体系的建立 47 4．3 Menin过表达对细胞的影响 47 4．4 Menin限量表达对细胞的影响 48 5结论与研究展望 49 5．1结j沧 ．．49 5．2创新点 49 5．3研究展望 49 参考文献 51 j}【谢 ． 58 万方数据 山东农业大学硕士学位论文中文摘要 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性，增加乳腺上皮细胞的 数量对提高产奶量具有重要意义。MENl编码menin蛋白，在细胞增殖分裂、细胞周期 调控以及转录